高 亮, 乔晓强, 梁 振, 张丽华＊, 霍玉书, 张玉奎

(1.中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析化学重点实验室,国家色谱研究分析中心,辽宁大连116023;2.中国科学院研究生院,北京100039;3.美国得克萨斯大学,圣安东尼奥78229-3900)

基于在线二维色谱的不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析

高 亮1,2, 乔晓强1,2, 梁 振1, 张丽华1＊, 霍玉书3, 张玉奎1

(1.中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析化学重点实验室,国家色谱研究分析中心,辽宁大连116023;2.中国科学院研究生院,北京100039;3.美国得克萨斯大学,圣安东尼奥78229-3900)

建立了基于在线二维弱阴离子交换色谱-反相液相色谱(2D-WAX-RPLC)的蛋白质分离系统,并用于不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析。以5种标准蛋白质的混合物为样品,考察了系统的重现性。通过改变标准蛋白质之间的浓度比,研究了该系统进行蛋白质相对定量的能力。在此基础上,针对4个不同生长时期的鹿茸样品,分别采用5种不同的方法进行蛋白质提取,经2D-WAX-RPLC分离后,收集各生长时期对应蛋白质的峰高最大比超过2的组分。酶解后,采用微柱反相液相色谱-串联质谱(μRPLC-MS/MS)进行肽段的分离鉴定;共从9个差异蛋白质峰中鉴定到了22个差异蛋白质。研究结果表明,利用基于蛋白质水平的在线二维液相色谱分离技术找寻差异蛋白质,具有重现性好、自动化程度高等优点,可用于开展比较蛋白质组学的研究。

在线二维液相色谱;鹿茸;蛋白质组;不同生长时期;比较蛋白质组学

Abstract:A method of on-linetwo-dimensional weak anion exchange Chromatography-reversed-phase liquid Chromatography(2D WAX-RPLC)was established,and applied for the comparative proteome study of antlers with four different grow ing stages.A five-p rotein-mixture was used as the sample to evaluate the reproducibility of the system.In addition,the capacity of such a system for the relative quantitative analysis was demonstrated by analyzing protein mixtures with different concentration ratios.Furtherm ore,five different lysis buffers were used to extract proteins from antlers with different growing stages.After the protein separation with2D WAX-RPLC,the fractions with maximum peak height ratio larger than2were collected,digested,and further identified by micro-reversed-phaseliquid Chromatography-tandem mass spectrometry(μRPLC-MS/MS).In total,22differential proteins were identified from9 fractions.Our experimental results dem onstrated that2D WAX-RPLC based protein separation has the advantages of good rep roducibility and automation,and might be a complementary method of two-dimensional gel electrophoresis for comparative proteome study.

Key words:on-line two-dimensional liquid Chromatography(2D LC);antler;proteom e;different growing stages;comparative proteomics

鹿茸是哺乳动物独立的最迅速的再生器官。它可在60d内迅速生长发育成含有强大的血管系统,并具有成骨、造血、神经、表皮生长、生毛等功能的成熟器官[1,2];在成熟后,血管又可在3～5d大量凋亡,同时软骨迅速骨化[3]。鹿茸从新生到凋亡是各种大分子活性蛋白质与小分子辅助因子共同作用的结果。因此,作为神经、血管、结缔组织、软骨、皮肤和骨骼协调的快速再生模型,鹿茸的研究一直受到人们的关注[4,5]。以鹿茸为模型,开展不同生长阶段中鹿茸蛋白质变化的研究,可以帮助我们在短时间内探讨生命体修复与再生现象。

近年来,研究不同生物学状态下蛋白质表达差异的比较蛋白质组学已成为后基因组时代的研究热点之一[6]。传统的比较蛋白质组学研究主要基于二维凝胶电泳(2D-PAGE)技术[7,8]。在完成蛋白质分离后,用考马斯亮蓝染色法或银染法对蛋白质染色,切取感兴趣的差异组分,酶解后进行质谱鉴定[9-11]。然而该方法不仅灵敏度低、重现性差,而且操作费时,容易造成样品损失。U nlu等[12]提出的双向差异凝胶电泳(D IGE)正逐渐成为比较蛋白质组学研究的主流技术。该方法主要采用3种不同的荧光染料(Cy2、Cy3、Cy5)对拟比较的蛋白质样品进行荧光标记[13],等量混合后在同一块胶上运行D IGE分离。经不同波长扫描,即可得到3个样品的图像,并通过蛋白点不同荧光信号间的比值来确定差异蛋白质[14-18]。尽管该方法的灵敏度和重现性较传统的2D-PAGE已有提高,但其在极酸、极碱、极大、极小和极疏水性等蛋白质的分离方面仍有局限性[19,20]。此外,Cy2、Cy3和Cy5的水溶性较差,在标记过程中可能引起蛋白质沉淀。这都会限制该技术在比较蛋白质组学研究中的应用。

另一类比较蛋白质组学研究的常用技术是基于高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)的技术。目前主要通过对标签修饰的肽段进行分离、鉴定和比较。常用的标记方法可分为同位素亲和标签(ICAT)技术和相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术。前者采用含轻重同位素和生物素的亲和标签标记半胱氨酸,利用亲和素富集后进行HPLC-MS/MS分析[21];后者利用能与氨基反应的同位素标签同时对多个样品的酶解产物标记后,再根据HPLC-MS/MS的分析结果进行比较蛋白质组学研究[22,23]。这两种方法均是在肽段水平上对蛋白质进行定量分析。然而,和蛋白质水平的分离相比,肽段的数目巨大,影响了分离鉴定的分辨率和准确性[24,25]。

本文发展了一种基于二维弱阴离子交换色谱-反相液相色谱(2D-WAX-RPLC)的蛋白质水平分离的比较蛋白质组学研究方法,并将其成功应用于不同生长时期的鹿茸蛋白质的差异分析。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

WAX采用Jasco HPLC仪,包括四元梯度泵(PU-2089Plus)、自动进样器(AS-2055Plus)、紫外检测器(UV-2075Plus)和LC-N etⅡ/ADC控制系统(Jasco公司,日本)。蛋白质分离的WAX色谱柱为TSKgel D EAE-5PW(75mm×7.5mm,100nm(1 000)(TOSOH公司,日本)。

自动十通阀为Rheodyne MX7960(Upchurch公司,美国)。捕集柱为自填装C8柱(50mm×4.6 mm,5μm,30nm(300A。),大连思谱精工公司)。

RPLC分离在Jasco HPLC仪(包括泵(PU-1580)、梯度控制单元(LG-1580-04)和紫外检测器(UV-1575))上进行。蛋白质分离的RPLC色谱柱为自填装C8柱(250mm×4.6mm,5μm,30nm(300),大连思谱精工公司)。

质谱仪为LCQ DUO离子阱质谱(Therm o Fisher公司,美国),与paradigm GM4μHPLC系统(M ichrom B ioresources Inc.,美国)联用。肽段分离的μRPLC色谱柱为自填装C18柱(50mm×0.3 mm,5μm,20nm(200A。),天津博纳公司)。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸胍、二硫苏糖醇(D TT)、细胞色素C(相对分子质量(Mr)为14 000,p I=9.6)、肌红蛋白(Mr=16 890,p I=7.2)、碳酸酐酶(Mr=29 023,p I=6.6)、牛血清白蛋白(BSA,Mr=69 000,p I=5.8)、β-乳球蛋白(Mr=35 000,p I=5.1)和胰蛋白酶购自美国Sigm a公司;三氟乙酸(TFA)购自比利时Acros公司;乙二胺四乙酸钠(ED TA)、HC l和N aOH购自天津科密欧试剂公司;色谱纯乙腈购自德国M erck公司;实验用水经法国M illi-Q系统纯化。

生长期分别为15,30,50和90d的马鹿鹿茸采自抚顺清原马鹿养殖场。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

分别配制6m g/mL的细胞色素C、肌红蛋白、碳酸酐酶、牛血清白蛋白和β-乳球蛋白储备液,等体积混合后用于评价2D-WAX-RPLC系统。

依次记生长期分别为15,30,50和90d的马鹿鹿茸为生长期1,2,3和4。将鹿茸在液氮条件下冷冻后研磨粉碎,分别加入1.2mol/L HCl、2 mol/L N aOH、100mmol/L Tris+6mol/L盐酸胍、100mmol/L Tris+6mol/L盐酸胍+0.5mol/L ED TA以及100mmol/L Tris+6mol/L盐酸胍+0.5mol/L ED TA+65mmol/L D TT5种溶液(均含1%蛋白酶抑制剂Cocktail Set I)(按1g鹿茸加入4mL的比例加入每种溶液)。在4℃下提取蛋白质24h,依次标记为蛋白质提取液1,2,3,4和5。离心后取上清液过0.45μm滤膜,并用B radford法测定蛋白质浓度[26]。将5种蛋白质提取液等体积混合并除盐后,用WAX初始流动相复溶。

1.2.2 2D-WAX-RPLC分离

利用十通阀连接WAX和RPLC,并采用两根C8捕集柱交替地将第一维洗脱组分捕集后,送入RPLC色谱柱进行进一步的分离,系统示意图见图1。

图1 2D-WAX-RPLC系统示意图Fig.1 Schem a tic d iagram of2D WAX-RPLC

采用5种标准蛋白质的混合物评价2D-WAXRPLC系统的重现性。第一维WAX的色谱条件:流动相A为50mmol/L Tris-HC l(pH8.0),流动相B为50mmol/L Tris-HC l+1mol/L N aC l(pH8.0);流速1mL/m in;4个台阶梯度依次为10%B,25%B,40%B和55%B;检测波长为214nm。第二维RPLC的色谱条件:流动相A为水(含0.1%TFA),流动相B为95%乙腈(含0.1%TFA);流速1 mL/m in;梯度洗脱程序:0-10m in,5%B;10-40 m in,30%B-60%B;检测波长为214nm。

在分离不同生长时期的鹿茸蛋白质样品时,第一维WAX的色谱条件:流动相A为50mmol/L Tris-HCl(pH9.0),流动相B为50mmol/L Tris-HC l+1mol/L N aCl(pH9.0);流速1mL/m in;9个台阶梯度依次为0%B,4%B,8%B,12%B,20%B,30%B,40%B,50%B和100%B;检测波长为214nm。第二维RPLC的色谱条件:流动相A为水(含0.1%TFA),流动相B为95%乙腈(含0.1%TFA);流速1mL/m in;梯度洗脱程序:0-10 m in,2%B;10-70m in,25%B-60%B;70-80 m in,80%B;检测波长为214nm。

1.2.3 差异蛋白质的鉴定

根据2D-WAX-RPLC分离的二维谱图,选取对应蛋白质峰的峰高最大比超过2的馏分进行收集,作为4个生长时期之间有显著差异的蛋白质。将这些馏分冻干后重溶于50mmol/L Tris-HC l(pH 8.3)缓冲液,按照蛋白质与酶的质量比为50∶1的比例加入胰蛋白酶,于37℃振荡酶解24h后,加入甲酸终止酶解反应。

采用μRPLC-MS/MS分离鉴定差异蛋白质的酶解产物,重复进样3次。色谱条件:流动相A为0.1%甲酸+98%水+2%乙腈,流动相B为0.1%甲酸+98%乙腈+2%水;流速5μL/m in;梯度洗脱程序:0-10m in,0%B;10-55m in,0%B-40%B;55-60m in,40%B-80%B。质谱采用正离子扫描模式,喷雾电压2.0kV,加热毛细管温度150℃,扫描范围:m/z400～2 000;二级质谱采集选择数据依赖模式,取一级质谱图中丰度最高的两个离子作为母离子,碰撞能量35%。

1.2.4 数据分析

质谱数据采用B iow orks3.1检索系统(Therm o Fisher公司)进行检索。哺乳动物数据库下载自美国国立生物技术信息中心(NCB I)网站(2007年7月11日)。母离子和子离子质量容忍范围分别为2和1。采用胰蛋白酶全酶切对肽段结果进行搜索,最高允许两个漏切位点。搜索结果采用Xcorr函数进行过滤,单电荷离子Xcorr≥1.90,双电荷离子Xcorr≥2.20,三电荷离子Xcorr≥3.75。

2 结果与讨论

2.1 在线2D-WAX-RPLC分离标准蛋白质混合物

如图1所示,WAX模式下蛋白质根据带电情况进行分离;经台阶梯度洗脱后,各组分交替捕集到位于十通阀上的两个平行C8捕集柱上;随后,依次进入RPLC色谱柱,根据蛋白质的疏水性进行分离。由于两维之间的分离机理具有正交性,从而确保了2D-WAX-RPLC系统具有较高的分辨率和峰容量。

选取质量浓度均为1.2m g/mL的5个标准蛋白质的混合物对2D-WAX-RPLC系统进行了评价。从基于Transform软件制作的2D-WAX-RPLC谱图(图2a)可以看出,在WAX柱上,细胞色素C、肌红蛋白和碳酸酐酶在第二个台阶内被洗脱;β-乳球蛋白和牛血清白蛋白在第三个台阶内被洗脱。这两组蛋白质在第二维RPLC柱上均得到了进一步分离,实现了5种蛋白质的完全分离。

图2 5种标准蛋白质混合溶液的2D-WAX-RPLC分离二维投影图Fig.2 two-dim ensiona l con tou r p lo ts of a five-p rote in mixture sepa ra ted by2D-WAX-RPLC

为了进一步考察该2D-WAX-RPLC系统进行蛋白质相对定量分析的能力,将蛋白质混合物中细胞色素C和牛血清白蛋白的浓度降低一半,肌红蛋白浓度增加一倍,其余蛋白浓度不变。如图2b所示,相对于图2a,细胞色素C和牛血清白蛋白的峰强度降低了约一半;肌红蛋白的峰强度增加了约一倍;其余色谱峰强度不变。这均与其浓度变化一致,表明该系统可用于开展蛋白质的相对定量研究。

为了确保相对定量的准确性,考察了2D-WAXRPLC系统对蛋白质混合物分离的重现性。从表1可看出,在6次连续运行中,5种标准蛋白质保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)均小于1%;在连续5d运行中,保留时间和峰面积的RSD值均小于3%。充分证明该系统具有很好的重现性。

表1 5种标准蛋白质的保留时间和峰面积的日内、日间重现性Table1 Intraday and interday reproducibilities of the re tention times and peak areas of fivestandard prote ins%

2.2 不同生长时期鹿茸蛋白质的分离

将在线2D-WAX-RPLC系统用于4个不同生长时期鹿茸蛋白质样品的分离。由于样品较复杂,将第一维WAX的台阶梯度增加为9个,第二维RPLC的梯度时间延长为80m in。由Transform软件制作的2D-WAX-RPLC分离图见图3。可看出4个生长时期的鹿茸蛋白质有着较为明显的差异。

收集上述二维图中对应蛋白质峰的峰高最大比超过2的馏分(如图3中圈示)作为4个生长时期之间有显著差异的蛋白质。

2.3 不同生长时期鹿茸差异蛋白质的比较

将上述收集的具有显著差异的蛋白质馏分冻干后酶解,并用μRPLC-MS/MS进行分离鉴定。在对不同生长时期的鹿茸差异蛋白质进行比较时,选取至少两次进样都能鉴定得到的蛋白质。其中一些蛋白质,包括线粒体内膜蛋白α螺旋结构域、依赖cAM P的蛋白激酶、泛素蛋白连接酶、转录调节因子和神经胶质丝状酸性蛋白等在4个生长时期鹿茸中均能鉴定得到。这可能是受平台分离能力所限,这些蛋白质和与之性质接近的差异蛋白质共流出,或者这些蛋白质在不同生长时期的鹿茸中存在量的差异,而不是有无的差异。

根据蛋白质有无的差异,从9个差异蛋白质馏分中共计鉴定得到了22个在4个生长时期中有显著差异的蛋白质(见表2),其中Mr大于100 000的蛋白质有8个,占差异蛋白质总数的36%;而Mr小于20 000的蛋白质有两个,占差异蛋白质总数的9%。这表明,采用2D-HPLC进行蛋白质分离,能在一定程度上改进二维凝胶电泳在分离极大和极小蛋白质方面的不足。

图3 4个生长时期鹿茸蛋白质的2D-WAX-RPLC分离二维投影图Fig.3 two-dimensional contour plots of antler proteins from the antler with four growing stages separated by 2D-WAX-RPLC(Cycled fractions with relative peak height ratios over2we recollected for further prote in ide tification.)

表2 4个生长时期鹿茸中的差异蛋白质Table2 Differential proteins identified from antlers from four growing stages

对发现的22个差异蛋白质的功能进行了研究,发现其中包括了与代谢相关的蛋白质8个(占36%),与复制、转录、翻译相关的蛋白质6个(占27%),与细胞生长及分裂相关的蛋白质4个(占18%),与信号转导及磷酸化相关的蛋白质2个(占9%),结构蛋白质1个(占5%)和未知功能蛋白质1个(占5%)。其中占多数的是与代谢相关的蛋白质,8个与代谢相关的蛋白质中的7个在生长期为1和2的鹿茸中鉴定得到,这可能与鹿茸生长前期代谢较为旺盛,而后期由于骨化形成、代谢变缓有关。

3 结论

本文建立了一种基于蛋白质的在线二维液相色谱分离的比较蛋白质组研究方法,并将其用于4个不同生长时期鹿茸差异蛋白质的分析。共从9个蛋白质差异峰中鉴定得到了22个差异蛋白质。实验结果表明,这种基于蛋白质水平的液相色谱分离的方法具有很好的重现性和鉴定差异蛋白质的能力。

通过进一步提高系统的分离能力和检测灵敏度,该方法将有望为开展比较蛋白质组学研究提供一种新的技术。

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GAO Liang1,2,Q IAO Xiaoqiang1,2,LIANG Zhen1,ZHANG Lihua1＊,HUO Yushu3,ZHANG Yukui1
(1.Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry,National Chromatographic R.& A.Center,Dalian Institute of Chemica l Physics,Chinese Academy of Sciences,Da lian 116023,China;2.Graduate School of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100039,China;3.The University of Texas,San Antonio,Texas 78229-3900,USA)

O658

A

1000-8713(2010)02-0146-06

＊通讯联系人:张丽华,博士,研究员,主要研究方向为蛋白质组学分离鉴定新技术新方法的研究.Tel:(0411)84379720,E-m ail:lihuazhang@dicp.ac.cn.

国家重大科学研究计划项目(No.2007CB914100)和国家自然科学基金项目(No.20775094).

2009-12-28

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00146