伍小燕,陈 朝,张国伟

(1.广西中医学院第一附属医院药剂科,广西南宁,530023;2.河北大学中医系,河北保定,071000)

泽泻(Rhizoma Alismastis)为泽泻科植物泽泻 Alisma orientalis(Sam)Juzep的干燥块茎,具利小便、清湿热的功效,主治小便不利、水肿涨满、泄泽尿少、热淋涩痛、痰饮眩晕、高血脂等。目前泽泻利尿机制尚未完全阐明[1],本实验对泽泻利尿机制做了以下初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器:代谢笼,苏州冯氏实验动物设备有限公司;生化仪,日立 7180型全自动生化仪;PCR仪,ABI 7 50 0 Real Time PCRSystem;BIO-RAD Gel Dox XR凝胶成相系统。

1.1.2 动物:雄性SD大鼠,来自于广东医学实验动物中心,动物使用前于实验环境中适应3 d,动物饲养环境,温度为(23±2)℃,湿度为(55±5)%,12 h/12 h白昼交替,自由饮水,标准饲养饲料。

1.1.3 试药:泽泻颗粒(泽泻水提物,江阴天江药业有限公司,每克相当于10 g生药,用前按剂量溶于生理盐水);呋塞米(上海复星朝晖药业有限公司);TIANScript cDNA Synthesis Kit、Real-MasterMix、SYBR GreenⅠ(北京 TIANGEN 公司)。

1.2 方法

1.2.1 合格实验大鼠筛选及分组:雄性SD大鼠50只,体重180～200 g,预先置于代谢笼中适应环境12 h,按4%体重灌胃给予生理盐水后立即被放入代谢笼中(1只/笼),收集6 h尿液,测量尿量、尿 Na+、尿 K+,尿Cl-,计算出各指标的正常值范围( x±1.96 s),选择以上4个指标均在正常范围内的大鼠30只,分为5组,即生理盐水组,呋塞米组,泽泻100 mg/kg组,泽泻500 mg/kg组,泽泻1 000 mg/kg组,每组6只。

1.2.2 泽泻利尿实验:合格实验大鼠,实验前每只动物置于独立代谢笼中预适应24 h,禁水不禁食,第2天给供试药品,分别经口给予生理盐水,呋塞米10 mg/kg,泽泻100 mg/kg,泽泻 500 mg/kg,泽泻1 000 mg/kg,剂量为1 mL/100 g。给药前按大鼠体重给予2.5 mL/100 g的生理盐水负荷,30 min后给药。给药8次,每天1次,收集第1次和第8次给药后24 h尿液,记录第1次给药后1、6、24 h及8次给药后24 h尿量,尿液在4℃以3 000 r/min,离心10 min,去除细胞残骸和食物残渣,以自动生化仪检测尿Na+、尿K+,尿Cl-水平。实验结束后,眼静脉丛采取血样,剪取大鼠左右肾脏组织及膀胱组织,4℃PBS漂洗后装入编码容器内,放入-70℃冰箱中以备用。

1.2.3 总RNA提取,cDNA制备及RT-PCR实验:取大鼠肾脏髓质约10 0mg及膀胱约50 mg,Trizol法提取总RNA,以TIANGEN公司cDNA第一链合成试剂盒制备cDNA。RTPCR实验条件为,变性,94℃,20s;退火,60℃,20 s;延伸,68℃,33 s。AQP2(174 bp)引物参考文献[2],AQP2 sense,TTGCAGGAACCAGAC ACTTG;antisense,GCGGAGACGAGCACTTT TAC;β-actin(150bp)为参比基因。

2 结 果

2.1 泽泻水提物对正常大鼠尿量影响

1次给药后,泽泻水提物 100 mg/kg,500 mg/kg剂量在1 h内有明显利尿作用,所有泽泻水提物在6 h后均可产生显著的利尿效应,尿量与呋塞米10 mg/kg组比较并无显著性差异(图1)。给药8 d后,泽泻水提物有显著性利尿效果,尿量与呋塞米10 mg/kg组比较,无显著性差异。

图1 各组大鼠24 h内尿量比较

2.2 泽泻水提物对正常大鼠尿液Na+,K+和Cl-浓度的影响

1次给药及8次给药后,泽泻水提物可显著提高大鼠尿Na+,尿K+和尿Cl-水平,并且泽泻组大鼠尿Na+,尿K+和尿Cl-水平均高于呋塞米10 mg/kg组,尤以8次给药后更加明显(见表1,2)。

表1 各组大鼠给药8 d后尿量及尿液Na+,K+和Cl-浓度比较( ±s,n=6)

表1 各组大鼠给药8 d后尿量及尿液Na+,K+和Cl-浓度比较( ±s,n=6)

与生理盐水组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01;与呋塞米10 mg/kg组比较,#P<0.05,##P<0.01。

组别 尿量(mL)Na+(mmol/L)K+(mmol/L)Cl-(mmol/L)生理盐水组 21.52±1.30 89.78±5.35 82.23±15.75 125.46±39.71呋塞米10 mg/kg组 29.30±3.13＊＊ 112.18±4.26＊＊ 93.80±6.91 163.76±6.72＊＊泽泻100 mg/kg组 24.85±2.25＊ 123.65±2.75＊＊## 112.24±5.74＊## 185.63±2.92＊＊##泽泻500 mg/kg组 25.85±1.96＊ 112.31±3.63＊ 102.94±5.75＊ 171.04±3.41＊＊#泽泻1 000 mg/kg组 29.17±3.15＊＊ 135.76±3.46＊## 133.01±2.52＊＊## 220.61±5.91＊＊##

表2 各组大鼠1次给药后尿液Na+,K+和Cl-的浓度比较( ±s,n=6)

表2 各组大鼠1次给药后尿液Na+,K+和Cl-的浓度比较( ±s,n=6)

与生理盐水组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01;与呋塞米10 mg/kg组比较,#P<0.05。

组别 Na+(mmol/L)K+(mmol/L)Cl-(mmol/L)生理盐水组 89.08±9.12 80.78±16.20 130.61±23.01呋塞米10 mg/kg组 123.24±19.10＊ 102.13±8.92＊ 182.23±24.58＊泽泻100 mg/kg组 126.25±8.37＊＊ 112.05±24.62＊ 186.83±16.56＊＊泽泻500 mg/kg组 123.34±6.77＊＊ 112.32±20.95＊ 183.23±29.45＊泽泻1 000 mg/kg组 135.41±11.53＊＊ 120.85±11.25＊＊# 201.55±27.35＊＊

2.3 泽泻水提物对对正常大鼠肾脏髓质AQP2 mRNA影响

分别以RT-PCR方法检测大鼠肾脏髓质及膀胱组织中AQP2mRNA表达情况,结果显示可在肾脏髓质组织中检测到AQP2 RT-PCR产物,在膀胱组织中不能检测到AQP2 RT-PCR产物,故本实验检测肾脏髓质AQP2 mRNA表达(图2)。泽泻水提物及呋塞米10 mg/kg组大鼠AQP2 mRNA相对表达含量与生理盐水组比较,明显下降,差异有显著性差异(P<0.05或P<0.01),见图3。

图2 膀胱、肾脏髓质AQP2 RT-PCR产物电泳图

图3 各组大鼠肾脏髓质AQP2 mRNA相对含量表达

2.4 肌酐清除率

各组大鼠血肌酐清除率与生理盐水组比较结果显示,差异无显著性差异,P>0.05。

3 讨 论

本实验采用Kau法筛选利尿合格大鼠,Kau法是1984年Kau对Aston法进行改进[3]提出的大鼠利尿筛选方法,Kau法样本少、易重复、实验周期长,更适合中药药理学的研究。利尿有两种影响因素,即增加尿量或电解质缺失[4],对照药呋塞米可以增加尿量,通过抑制Na+/K+/2Cl-转运子增加尿Na+排出。

对于水饱和大鼠,单次及连续8次给药均可以显著增加大鼠尿量,增加大鼠尿Na+,尿K+和尿Cl-水平。本实验中,连续给予8次呋塞后,大鼠尿K+与生理盐水组比较,升高趋势明显,但不具统计差异,原因可能是实验动物数量不足。据实验中观察及大鼠血清肌酐清除率水平,在实验的8 d中,泽泻未表现出明显的毒性。

AQP2存在于肾脏集合管的主细胞中,参与调节尿液的生成[5-6]。AQP2为ADH依赖型水通道蛋白,ADH对主细胞管腔膜AQP2调节是通过细胞内介导物质环腺苷酸(cAMP)进行的,cAMP能够激活胞浆内蛋白激酶释放出各种蛋白酶物质,并转而作用于胞浆与管腔膜上的磷酸蛋白,通过细胞骨骼微管与微丝的功能活动使胞浆内AQP2小泡与管腔膜融合,小泡膜上AQP2嵌入管腔膜,极大地提高了管腔膜水通道蛋白数量和管腔膜水渗透通透性,当肾髓质集合管内外存在显著渗透浓度差时,就极大地提高了集合管对水的重吸收[7-8]。连续给予大鼠8次泽泻水提物后,可显著降低其AQP2 mRNA含量表达。值得一提的是,泽泻100 mg/kg剂量组大鼠 AQP2 mRNA相对表达含量下降幅度最大。

实验提示泽泻水提物可显著增加大鼠尿量,增加大鼠Na+,尿K+和尿Cl-水平,具显著利尿活性,其利尿活性可能为通过调节降低肾脏髓质AQP2表达产生。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(精选本下册)[M].上海:上海科技出版社,1998:1993.

[2]Zhang G,Zeng X,Han L,et al.Diuretic activity and kidney medulla AQP1,AQP2,AQP3,V2R expression of the aqueous extract of sclerotia of Polyporusumbellatus FRIES in normal rats[J].J Ethnopharmacol,2010,128(2):433.

[3]Kau ST,Keddie JR,Andrews D.A method for screening diuretic agents in the rat[J].J Pharmacol Methods,1984,11(1):67.

[4]王登平.慢性心力衰竭合并低钠血症 40例的治疗[J].海南医学院学报,2006,12(6):526.

[5]陈侠,黄中新.水通道蛋白在急性实验染毒大鼠肾脏的表达及意义[J].解剖学研究,2010,32(2):110.

[6]Xie L,Hoffert JD,Chou CL,et al.Quantitative analysis of aquaporin-2 phosphorylation[J].American Journal of Physiology,2010,298(2):1018.

[7]Hasler U,Mordasini D,Bens M,et al.Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells[J].J Biol Chem,2002,277(12):10379.

[8]崔成国,赫惠新,潘绍惠,等.AQP1、AQP2及AQP3在人睾丸肿瘤组织中表达的检测[J].2007,2(5):36.