陈美珍，余 杰，杨拉维，潘群文

(汕头大学理学院生物系，广东 汕头 515063)

龙须菜多糖硫酸化对免疫活性的影响

陈美珍，余 杰，杨拉维，潘群文

(汕头大学理学院生物系，广东 汕头 515063)

分别采用改良的氯磺酸-吡啶法和HCl-甲醇法对龙须菜多糖进行硫酸化修饰与脱硫处理，探讨不同硫酸基含量的天然多糖、硫酸化多糖和脱硫多糖对由环磷酰胺引起的免疫力低下小鼠免疫功能的影响。结果表明：与模型组比较，天然多糖对提高小鼠的脾脏指数(P＜0.05)、巨噬细胞的吞噬活性(P＜0.05)、脾细胞增殖转化能力(P＜0.05)、NK细胞杀伤活性(P＜0.01)等作用最强，其次是硫酸化多糖，而脱硫多糖作用最弱；这3种多糖都能显著促进免疫抑制小鼠的溶血素和溶血空斑的形成(P＜0.01)，其中天然多糖和硫酸化多糖优于脱硫多糖。显示龙须菜多糖能显著提高免疫力低下小鼠的免疫功能，但多糖中硫酸基含量与免疫作用非线性关系，增加或脱除天然多糖硫酸基其免疫活性均下降，尤其是脱除硫酸基后免疫活性显著降低。

龙须菜多糖；硫酸基；免疫活性

Abstract：Improved chlorosulfonic acid/pyridine and HCl/methyl alcohol methods were used for sulfurizing and desulfurizing native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides, respectively. The immunoregulatory effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides in mice with low immunity induced by cyclophosphamide were investigated.Compared with the model group, native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides were the most effective in improving spleen index (P＜0.05), phagocytic activity of macrophages (P＜0.05), proliferation and transformation of spleen cells (P＜0.05) and NK cell killing activity (P＜0.01), followed by sulfurized and desulfurized ones. All three polysaccharides could significantly improve the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice (P ＜ 0.01), native and sulfurized Gracilaria lemaneiformis polysaccharides were superior to desulfurized ones. Based on these results, it can be concluded that Gracilaria lemaneiformis polysaccharides significantly increase the immune function in immunocompromised mice, that sulfate content in Gracilaria lemaneiformis polysaccharides is nonlinearly related to their immunoregulatory effect in immunocompromised mice, and that both sulfurization and desulfurization decrease the immunoregulatory effect of native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides, especially desulfurization resulted in a significant decrease.

Key words：polysaccharides from Gracilaria lemaneiformis；sulfate；immunocompetence

龙须菜(Gracilaria lemaneiformis) 隶属于红藻门(Rhodophyta)、红藻纲(Rhodophyceae)、真红藻亚纲(Florideae)、杉藻目(Gigartinales) 、江蓠科(Gracilariaceae)江蓠属(Gracilaria) 红藻。目前，龙须菜在我国已经成为继海带、紫菜、裙带菜之后的第四大栽培海藻，资源日益丰富[1]。龙须菜含有占干质量31.05%的硫酸多糖[2]，其具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和增强免疫力等多种生理活性[3-6]，具有很好的研究开发利用价值。大量的研究表明，藻类多糖的生理活性主要受多糖相对分子质量、硫酸基含量以及多糖的空间构象的影响[7-8]。对大多数硫酸化多糖而言，若将硫酸基去除，则其活性降低或消失(尤其是抗病毒活性)[9-10]。

研究发现龙须菜多糖的抗病毒活性与其硫酸基含量有关[4]；龙须菜多糖经脱硫酸作用后，硫酸基含量下降，其免疫活性相应降低[11]。为了进一步揭示龙须菜多糖硫酸基与其生理活性的关系，本研究在前期完成了龙须菜多糖硫酸化修饰和脱硫酸化作用的工艺条件优化的基础上，制备不同硫酸基含量的多糖样品，探讨多糖硫酸基含量对其免疫活性的影响，以期为龙须菜多糖的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人工养殖的新鲜龙须菜，KF981品系(由汕头大学海洋生物研究所陈伟洲高级工程师鉴定)，于2008年3月采自广东汕头南澳岛。

龙须菜天然多糖(精多糖)、硫酸化多糖、脱硫多糖均由本实验室制备，它们的硫酸基含量依次为：12.25%、24.67%、1.15%。多糖使用前均配成一定浓度的水溶液。

昆明种小鼠，体质量20～22g，清洁级，购于厦门大学实验动物中心，合格证号：SCXK闽2004-0001；HeLa细胞购于中科院上海生物细胞研究所。

考马斯亮兰G-250 FLuka 分装；RPMI-1640培养液、胰蛋白酶、刀豆蛋白A(ConA)、台盼蓝 Sigma公司；MTT Sangon公司；氯化钠注射液 福州海王福药制药有限公司；注射用环磷酰胺(CTX) 上海华联制药有限公司；豚鼠血清 上海晶天生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)；三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、四乙氧基丙烷(TEP)等均为国产分析纯；鸡红细胞 自制。

1.2 仪器与设备

CT5DL型日立离心机 Tokyo公司；N-1001S-WA旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社；Savant Modulyod冷冻干燥机 Termo公司；SS-325全自动灭菌柜 Tomy公司；UV mini-1240紫外可见分光光度计 岛津公司；Thermo Labsystems酶标仪 Thermo公司；CO2培养箱SheL Lab公司；超净工作台 Air Tech公司；96孔细胞培养板 G＆H公司；倒置显微镜 Olympus公司；FTIR Avatar 360红外光谱仪。

1.3 方法

1.3.1 不同硫酸基含量的多糖样品制备

天然多糖：用90℃、料水比1:100(m/V)热水提取龙须菜藻体多糖，提取液离心弃沉淀，上清液真空浓缩至1/3后用3倍量无水乙醇沉淀多糖，4℃放置过夜，离心，将沉淀物冷冻干燥，得龙须菜粗多糖。将粗多糖用水溶解，加入一定量TCA溶液(至TCA终质量浓度达到70g/100mL)，沉淀蛋白质，4℃放置过夜，离心后用质量分数10%的NaOH溶液中和糖液。然后将糖液在70～80℃温度下减压浓缩至一定体积后于蒸馏水中透析3d以上，低温浓缩至一定浓度后冷冻干燥得到龙须菜天然多糖(PGL)，经测定其多糖含量为94.48%，用凯式定氮法测定其粗蛋白的含量为0.98%。

1.3.2 多糖的硫酸化修饰

采用文献[12]改良法。将0.2g PGL粉末溶于35mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌30min后，加入17.5mL硫酸化试剂(氯磺酸与吡啶的体积比为1:6)，置于60℃水浴搅拌反应3h。反应结束后冷却至室温，反应液加入100mL冰水，用1mol/LNaOH中和至pH7.5，减压浓缩至一定浓度，用蒸馏水透析3d，透析液浓缩后经冷冻干燥得到硫酸化多糖。

1.3.3 多糖的脱硫

HCl-甲醇法[13-14]。取PGL1.00g，加入到100mL 0.065mol/L HCI-甲醇溶液中，将此溶液置于摇床内，转速220r/min，温度15℃，振荡24h后，离心，弃上清，向不溶物中重新加入100mL新鲜的HCl-甲醇溶液，继续振荡24h。如上重复2～3次后，用甲醇反复洗去HCl，晾干，复溶于蒸馏水，透析48h以上，浓缩，冷冻干燥。

1.3.4 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸比色法[15]，以D - 半乳糖作标准品。

1.3.5 硫酸基含量的测定

采用硫酸钡比浊法[15-16]，具体操作按文献[4]的方法进行。

1.3.6 多糖样品红外光谱分析

用FTIR Avatar 360红外光谱仪，KBr 压片，在400～4000cm-1之间扫描。

1.3.7 小鼠免疫作用实验

1.3.7.1 小鼠分组、造模、给药及脏器指数的测定

小鼠随机分为5组，每组12只，雌雄各半，各组体质量无显著差异，分别为对照组、模型组和3个给药组(天然多糖、硫酸化多糖和脱硫多糖组)。对照组每天灌胃生理盐水0.4mL和腹腔注射生理盐水0.4mL，模型组腹腔注射CTX 20mg/(kg bw·d)和每天灌胃生理盐水0.4mL，各给药组分别经灌胃给予相应的多糖溶液，剂量均为100mg/(kg bw·d)，同时腹腔注射CTX 20mg/(kg bw·d)，连续7d。给药7d后小鼠脱颈椎处死，无菌条件下剥取脾脏、胸腺器官称质量，计算脏器指数。

1.3.7.2 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定

按1.3.7.1节中的方法分组、造模及给药，给药7d后，每只小鼠腹腔注射质量分数5%的鸡红细胞生理盐水悬液0.5mL进行免疫，以文献[17]的方法检测免疫小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率。按式(2)、(3)求出巨噬细胞吞噬率及吞噬指数。

1.3.7.3 脾淋巴细胞增殖活性的测定

采用MTT 法测定各组小鼠脾淋巴细胞转化指数[18]。

按1.3.7.1节的方法分组、造模及给药。给药7d后各组小鼠脱颈椎处死，无菌取脾，常规制备脾细胞。将细胞溶于含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，台盼蓝染色计数(活细胞数95%以上)，调整细胞浓度为2×106个/mL，加入96孔培养板中，每孔200μL，再加入5μL 200mg/L的ConA溶液，对照孔加5μL的培养基代替，均设4个复孔。置37℃、5%CO2培养箱培养72h，培养结束前4h取出，每孔吸出100μL上清液，加入20μL，5mg/mL的MTT溶液(PBS配制，过滤除菌)，继续培养4h，离心弃上清，每孔加入150μL、37℃预温的DMSO，振荡10min，酶标仪测定570nm波长处的吸光度，参考波长630nm，计算淋巴细胞的增殖指数。

式中：A处理为加ConA孔吸光度；A对照为空白孔吸光度。

1.3.7.4 NK细胞杀伤活性测定

采用MTT法检测NK细胞杀伤活性[17-18]。同1.3.7.3节中的方法分组、造模、给药和制备脾细胞。用10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至5×107个/mL作为效应细胞。取传代培养的HeLa细胞作为靶细胞(调整其细胞浓度为1×106个/mL)。取靶细胞悬液加入96孔板，每孔100μL，提前培养8h。然后加入100μL效应细胞，效靶比为50:1，同时设靶细胞对照孔和效应细胞对照孔，均设4个复孔。置37℃、5%CO2培养箱中培养4h，取出后吸去上清液100μL，再向每孔加入5mg/mL溶液MTT 20μL继续孵育3h。离心弃上清，每孔加入100μL DMSO，振荡10min，酶标仪测定570nm波长处的吸光度，参考波长630nm，计算NK细胞杀伤活性。

式中：A靶细胞为靶细胞孔吸光度；A实验为靶细胞和效应细胞共同作用孔吸光度；A效应细胞为效应细胞孔吸光度。

1.3.7.5 溶血素及溶血空斑形成测定[17,19]

采用分光光度法，具体参照文献[19]的方法测定。

按1.3.7.1节的方法小鼠分组、造模、给药。给药第1天，各组小鼠均腹腔注射20%的鸡红细胞生理盐水混悬液0.2mL进行免疫。于第7天给药后2h，小鼠眼眶取血，3500r/min离心10min，分离血清。血清用生理盐水1:100 稀释后，取1mL 稀释液与20%的鸡红细胞混悬液0.5mL、100g/L的补体0.5mL ( 豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h) 混匀，37℃孵育30min，冰水浴中终止反应。另设不加补体的空白管作对照，吸取各管上清液于540nm波长处测吸光度，检测溶血素形成情况。

小鼠取血致死后，解剖取出脾脏，每两个小鼠脾脏放在一起，用匀浆器匀浆，用冷的都氏液调整脾细胞数为5×109个/mL混悬液。取脾细胞混悬液、0.2%鸡红细胞混悬液和1:10稀释的豚鼠血清各0.5mL 混匀。另设不加补体的空白对照，37℃孵育1h，3500r/min离心10min，取上清液于413nm波长处测吸光度，检测溶血空斑形成情况。

1.4 数据处理

数据处理采用SPSS 13.0 软件进行统计分析，结果均以(±s) 表示。组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 多糖的硫酸化修饰和脱硫结果

图1 3种多糖的红外光谱Fig.1 IR spectra of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides

从3种多糖的IR谱图(图1)可以看出，天然多糖经硫酸化和脱硫处理后，虽然曲线形状(吸收峰)有一定变化，但硫酸化和脱硫多糖的IR光谱在3400cm-1附近、在1400～1200、1200～1000cm-1处有多糖类化合物的特征性吸收峰[20]；在1074cm-1和931cm-1附近有3,6-内醚-半乳糖吸收峰[20]存在，而3,6-内醚键是不稳定的，可见天然多糖经硫酸化和脱硫处理后，其母体部位未改变。此外，3种多糖的IR光谱在1250cm-1附近都有一特征吸收峰，表明有硫酸基存在[20]，与天然多糖比较，硫酸化后的吸收峰显著增强，而脱硫后的吸收峰强度降低，表明了硫酸基含量发生了明显变化。至于天然多糖经硫酸化和脱硫处理后，多糖分子其他基团和空间构象如何变化等尚待结合其他方法进一步分析。

2.2 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响

表1 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响(±s，n=10)Table 1 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on immune organ indexes in immunocompromised mice (± s，n=10)

表1 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响(±s，n=10)Table 1 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on immune organ indexes in immunocompromised mice (± s，n=10)

注：*.与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)；**.与对照组相比有极显著性差异(P＜0.01)。△.与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)；△△.与模型组相比有极显著性差异(P＜0.01)。下同。

组别 脾脏指数/(mg/g) 胸腺指数/(mg/g)对照组 5.986±0.717 4.155±0.063模型组 3.519±0.407** 1.711±0.146**天然多糖组 5.034±0.824△ 1.739±0.350硫酸化多糖组 3.689±0.951 2.229±0.559脱硫多糖组 3.811±0.187 2.238±0.438

由表1可见，与对照组比较，模型组小鼠脾脏和胸腺指数均显著降低(P＜0.01)，说明成功建立免疫抑制模型。与模型组相比，各多糖组对CTX引起的脾脏和胸腺器官的萎缩具有一定的保护和修复作用，其中天然多糖对脾脏的保护作用效果较明显(P＜0.05)，其余各组无显著性差异，结果表明龙须菜多糖对免疫抑制小鼠免疫器官有保护作用，但这种作用与其硫酸基含量无相关性。

2.3 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响

2.3.1 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

表2 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(±s，n=10)Table 2 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on peritoneal macrophage function in immunocompromised mice(± s，n=10)

表2 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(±s，n=10)Table 2 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on peritoneal macrophage function in immunocompromised mice(± s，n=10)

组别 吞噬率/% 吞噬指数对照组 39.67±9.16 0.497±0.067模型组 33.27±5.15* 0.389±0.063*天然多糖组 45.49±2.14△ 0.508±0.042△硫酸化多糖组 40.14±2.80△ 0.483±0.069△脱硫多糖组 37.12±7.51 0.387±0.136

从表2可以看出，与对照组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率显著降低(P＜0.05)，说明成功建立免疫抑制模型。与模型组相比，天然多糖组和硫酸化多糖组均可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬率(P＜0.05)，其中天然多糖组作用比硫酸化多糖组强，而脱硫多糖组基本上无提高巨噬细胞吞噬能力。

2.3.2 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响

表3 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠免疫细胞活性的影响(±s，n=10)able 3 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on immune cell activity in immunocompromised mice (± s，n=10)

表3 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠免疫细胞活性的影响(±s，n=10)able 3 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on immune cell activity in immunocompromised mice (± s，n=10)

组别 脾淋巴细胞增殖指数/% NK细胞杀伤率/%对照组 97.65±1.64 37.8±0.04模型组 58.56±2.34** 12.2±0.15**天然多糖组 69.76±0.78△ 38.1±0.75△△硫酸化多糖组 56.38±4.39 20.8±0.14△脱硫多糖组 59.54±3.68 17.8±0.08△

由表3可见，与对照组相比，模型组小鼠脾淋巴细胞增殖指数显著降低(P＜0.01)，说明成功建立免疫抑制模型。与模型组比较，天然多糖组对促进脾淋巴细胞增殖作用显著(P＜0.05)，而硫酸化多糖组和脱硫多糖组则无此作用。

2.3.3 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠NK细胞杀伤活性的的影响

多糖对免疫抑制小鼠脾脏NK细胞杀伤力的影响如表3所示。模型组与对照组的数据表明，CTX能够显著抑制NK细胞的杀伤活性(P＜0.01)，说明成功建立免疫抑制模型。与模型组比较，各多糖组均能显著提高NK细胞杀伤活性，其中天然多糖组差异性极显著(P＜0.01)。

2.4 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠体液免疫功能的影响

表4 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠溶血素、溶血空斑形成的影响(±s，n=10)Table 4 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice (±s，n=10)

表4 多糖硫酸化对免疫抑制小鼠溶血素、溶血空斑形成的影响(±s，n=10)Table 4 Effects of sulfurized, desulfurized and native Gracilaria lemaneiformis polysaccharides on the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice (±s，n=10)

组别 溶血素A540nm 溶血空斑A413nm对照组 0.090±0.025 0.332±0.023模型组 0.061±0.018* 0.248±0.036**天然多糖组 0.107±0.031△△ 0.335±0.058△△硫酸化多糖组 0.091±0.021△△ 0.341±0.053△△脱硫多糖组 0.089±0.024△ 0.289±0.041△△

由表4可见，与对照组比较，模型组溶血素值和溶血空斑形成值显著下降，说明成功建立免疫抑制模型。与模型组比较， 各多糖组均可显著或极显著促进免疫抑制小鼠溶血素和溶血空斑的形成， 吸光度显著升高(P＜0.01)。结果表明，龙须菜多糖能显著提高免疫抑制小鼠的体液免疫功能，但多糖脱硫酸基后对体液免疫作用有所下降。

3 讨 论

龙须菜多糖能显著增强由CTX导致的免疫力低下小鼠的免疫能力。在所检测的各项免疫指标中，以天然多糖对提高脾脏指数、腹腔巨噬细胞吞噬活性，脾细胞增殖指数、NK细胞杀伤活性效果最好。总体上天然多糖显示出较强的细胞免疫作用，其次是硫酸化多糖，脱硫多糖对细胞免疫作用最弱。在对免疫抑制小鼠体液免疫增强作用方面，天然多糖和硫酸化多糖作用效果接近，脱硫多糖作用效果稍有下降。结果表明，龙须菜多糖脱去硫酸基后免疫作用下降，但多糖硫酸基含量增加其免疫活性未相应增加，说明龙须菜多糖对免疫抑制小鼠免疫增强作用与其硫酸基含量可能存在着某种特定的关系，但非线性关系。

朱地琴等[6]研究发现龙须菜非胶体多糖比胶体多糖有更高免疫活性，并认为这种差异可能主要是由于两者的硫酸基和甲氧基含量不同造成的。宫春宇等[11]报道了龙须菜多糖具有很好的刺激淋巴细胞增殖作用，但经脱硫酸作用后硫酸基含量下降，刺激作用也显著下降，这与实验的研究结果相似。

对硫酸化多糖的抗病毒活性研究发现，除了硫酸基聚阴离子特性外，引入硫酸基后所引起的多糖立体结构的变化也是硫酸化多糖产生生物学活性的重要原因[21]。尽管硫酸基与硫酸多糖的抗病毒活性密切相关，但并不是硫酸基越多活性越强，也不是所有多糖硫酸化后都能产生抗病毒活性，有些多糖硫酸化后反而使其原有活性消失，如裂褶多糖和某些真菌多糖经硫酸化后不但没有抗病毒活性，而且还失去了其原有的抗肿瘤活性，这被认为可能与多糖本身的立体结构有关[22]。本实验的研究也显示出增加天然多糖的硫酸基含量其免疫活性未能增加甚至还会下降，这一结果进一步支持了上述的论点。从本实验硫酸化修饰后的多糖红外光谱可以看出多糖经硫酸化修饰后其母体结构虽未见变化，但其组成结构有所改变，这种改变是否导致多糖本身的立体结构发生变化从而影响其免疫作用，值得深入研究探索。

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Immunoregulatory Effects of Sulfurized, Desulfurized and Native Gracilaria lemaneiformis Polysaccharides in Immunosuppressive Mice

CHEN Mei-zhen，YU Jie，YANG La-wei，PAN Qun-wen
(Department of Biology, College of Science, Shantou University, Shantou 515063, China)

Q539；TS201.2

A

1002-6630(2010)15-0278-05

2010-06-12

广东省科技计划项目(2009B020312012)；汕头市科技计划项目(2008-143)

陈美珍(1956—)，女，副教授，本科，主要从事天然活性物质的研究与开发。E-mail：chenmz@stu.edu.cn