仓义鹏，张宏志，董明盛,*

(1.宿迁市产品质量监督检验所，江苏 宿迁 223800；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)

苹果渣固态发酵产纳豆激酶的工艺优化

仓义鹏1，张宏志2，董明盛2,*

(1.宿迁市产品质量监督检验所，江苏 宿迁 223800；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)

在单因素试验基础上，确定尿素添加量、培养基加水量、氧化钙添加量为影响酶产率的重要因素，应用响应面分析法对固态发酵苹果渣产纳豆激酶的工艺条件进行优化。优化得到最佳工艺条件为：尿素添加量2.58%、培养基加水量84.06mL、氧化钙添加量2.65%。采用最优化条件进行实验，结果表明：纳豆激酶产率可达到2150IU/g，比单因素试验的最高酶产率(1680IU/g)提高了27.98%。以廉价的工农业废料作为基本培养基获得了有较高酶活的产品，经济优势明显。

苹果渣；纳豆激酶；固态发酵；工艺优化

Abstract ：On the basis of the results of one-factor-at-a-time experiments, urea concentration, water amount and calcium oxide concentration were determined to be the most important factors affecting on nattokinase production. Subsequently, response surface methodology was used to optimize these factors. The results showed that the optimal values of urea concentration,water amount and calcium oxide concentration were 2.58%, 84.06 mL and 2.65%, respectively. Under these conditions, the maximum nattokinase yield was 2150 IU/g, 27.98% higher than that obtained in one-factor-at-a-time experiments (only 1680 IU/g).The achievement of a high nattokinase activity using apple pomace, a low-cost industrial and agricultural waste as fermentation substrate demonstrates obvious economic advantages.

Key words：apple pomace；nattokinase；solid-state fermentation；process optimization

我国是世界上最大的苹果生产国，占世界总产量的1/3以上[1]。随着苹果产量的增加，果品深加工所带来的每年几百万吨苹果废渣的处置问题长期以来未得到有效解决，造成了资源的巨大浪费，同时也带来了严重的环境问题[2]。苹果渣富含碳水化合物等有机物质，是饲料、发酵工业、固态培养基等的良好原料。国内外在用苹果渣制备果胶、生产柠檬酸、做食用菌培养基质等方面均进行了深度开发[3-4]，但对以苹果渣为原料进行固态发酵生产纳豆激酶的研究还未见报道。

纳豆是日本的一种传统发酵食品，早在2000多年前，就已为日本人所食用，并用来治疗和预防心血管疾病[5]。1987年，日本须见洋行博士从纳豆中提取出一种具有溶栓功能的丝氨酸蛋白酶，并定名为纳豆激酶(nattokinase，NK)[6]。NK是一种治疗心脑血管疾病的理想候选药物。与其他传统溶栓剂相比，具有安全性好、成本低、易被人体吸收、作用直接迅速、作用持续时间长等优点[5]。同时NK作为功能性食品、食品添加剂和普通食品的发展也很迅速，其相关产品的开发已经成为世界各国研究的一个热点[7]。

本研究采用响应面设计的方法对NK固态发酵工艺进行优化，并对优化后的结果进行验证，为实现其工业化利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果渣购自徐州某果品厂。

凝血酶(酶活力190BP)、尿激酶(酶活力1280U) 中国药品生物制品检定所；纤维蛋白原 北京拜尔迪生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 菌种与培养基

纳豆芽孢杆菌DU115，由南京农业大学食品微生物研究室筛选并保存。

斜面培养基(按质量分数配制)：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%、琼脂2%；种子培养基(按质量分数配制)：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%；基础培养基(组分占干苹果渣质量的质量分数)：苹果渣35g、麸皮20%、尿素1.5%、氧化钙2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、水120mL。

1.3 苹果渣固态发酵工艺

1.3.1 菌种活化

将经斜面活化的菌种接入摇瓶种子培养基中，37℃、120r/min，恒温培养24h。

1.3.2 工艺流程

将基础培养基在高压锅内121℃条件下蒸煮20min，自然冷却至55℃以下。在无菌条件下，将事先活化好的菌液喷洒于苹果渣中搅拌均匀，于浅盘中铺成3～5cm的薄层，37℃恒温培养发酵24h[8-9]。发酵结束后取样分析。

1.4 粗酶液制备及酶比活力测定

综合有关NK测定的纤维蛋白平板法，略有改动，测定方法参见文献[10-11]。

纤维蛋白平板的制作：配制0.8%的琼脂糖溶液，煮沸10min，于55～60℃水浴中保温30min；配制0.8mg/mL纤维蛋白原溶液，45℃水浴保温20min。将7.5BP/mL凝血酶1mL与纤维蛋白原溶液和琼脂糖溶液同时混合，立即倒平板，待凝固后即为纤维蛋白平板，点样梯度浓度的尿激酶标准品，37℃恒温孵育18h，测其溶解圈直径，溶解圈垂直直径乘积对数与酶比活力对数呈线性相关。根据待测样品的溶解圈面积大小计算出待测样品相当于尿激酶的活力单位，以表示待测样品的酶产率。

尿激酶标准曲线的测定：配制100、200、300、400、500IU/mL的尿激酶标准溶液。取以上各浓度的尿激酶标准溶液10μL点样于纤维蛋白平板的滤纸片上，37℃培养18h，游标卡尺测量溶解圈的两垂直直径。以溶解圈垂直直径的乘积的对数作为横坐标，尿激酶浓度的对数为纵坐标，做尿激酶标准曲线。

粗酶液制备及点样：将发酵后苹果渣与0.85g/100mL的生理盐水按1:10(m/V)的比例混合，浸提1h，充分洗脱苹果渣中可溶性物质，然后将洗脱液于6000r/min离心10min，取上清液即所需的粗酶液[12]。

取10μL样品点样于纤维蛋白平板的滤纸片上，37℃培养18h，游标卡尺测量溶解圈的两垂直直径。参照尿激酶标准曲线的方程计算样品的酶产率。

图1 纳豆激酶标准曲线Fig.1 Nattokinase standard curve

1.5 响应面试验设计

在单因素试验分析结果的基础上，采用3因素3水平的Box-Behnken响应面设计方法[13-16]，对尿素添加量、培养基加水量和氧化钙添加量3个因素按照响应面试验设计，以NK的酶产率为指标进行优化，所有试验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 麸皮添加量对产酶的影响

以干苹果渣为基准，加入麸皮作为碳源，尿素1.5%、氧化钙2%、培养基加水量120mL、接种量11%，37℃培养24h，用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶比活力，比较添加不同添加量的麸皮对产酶的影响，结果见图2。

图2 麸皮添加量对产酶的影响Fig.2 Effect of wheat bran amount on nattokinase yield

由图2可知，添加麸皮有利于微生物产酶。因为麸皮除含有淀粉等碳水化合物以外，还含有丰富的维生素和矿物质，它们是微生物必需的生长因子。同时麸皮还是一种很好的膨松剂，保证了培养基内空气交换和热量散发，从而有利于纳豆芽孢杆菌代谢及纳豆激酶的生成。可见，麸皮添加量在10%时酶产率最高。

2.2 尿素添加量对产酶的影响

以干苹果渣为基准，加入尿素作为氮源，麸皮10%、氧化钙2%、培养基加水量120mL、接种量11%，37℃培养24h，用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶比活力，比较尿素添加量对产酶的影响，结果见图3。

图3 尿素添加量对产酶的影响Fig.3 Effect of urea concentration on nattokinase yield

由图3可知，尿素添加量由0%变化到2.5%，NK酶产率逐渐上升，增加趋势明显；当达到2.5%～4%时，酶产率逐渐下降。一方面采用微生物发酵生产菌体蛋白，需要保持较高的氮浓度，以促使微生物尽可能的利用无机氮合成蛋白质，另一方面过量的尿素会抑制菌体的生长，导致酶产率下降。综合考虑确定尿素添加量为2.5%。

2.3 接种量对产酶的影响

以液体种子进行接种量试验，麸皮10%，尿素2.5%，氧化钙2%，培养基加水量120mL，37℃培养24h，结果见图4。

图4 接种量对产酶的影响Fig.4 Effect of inoculum size on nattokinase yield

由图4可知，接种量为9%时，其酶产率最高。这说明接种量为3%～7%时由于菌体细胞量少，酶产率也相应比较低；接种量为11%、13%时，菌体细胞量太多，在菌体生长期营养物质消耗很快，到产酶期营养物质浓度降低，不利于菌体产酶。所以采取9%的接种量较为合适。

2.4 培养基加水量对产酶的影响

图5 培养基加水量对产酶的影响Fig.5 Effect of water amount on nattokinase yield

以干苹果渣为发酵基质，分别加入60、80、100、120、140、160、180mL的水，麸皮10%、尿素2.5%、氧化钙2%、接种量9%，37℃培养24h，比较培养基不同加水量对产酶的影响。结果见图5。

由图5可知，最适加水量为80mL。固态发酵中，培养基含水量要合适，固态发酵含水量过低，影响营养基质的溶解和传递以及颗粒的润胀等条件，不利于细胞生长。加水量过高不利于通气，使基质成团，影响氧的传递和发酵热的散失，导致酶产率下降。

2.5 氧化钙添加量对产酶的影响

用添加氧化钙调节培养基的pH值，以干苹果渣为基准，分别加入1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的氧化钙，测得相应初始pH值约为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在麸皮10%、尿素2.5%、培养基加水量80mL、接种量9%，37℃培养24h的条件下，比较氧化钙不同添加量对产酶的影响，结果见图6。

图6 氧化钙添加量对产酶的影响Fig.6 Effect of calcium oxide concentration on nattokinase yield

由图6可知，氧化钙添加量2.5%，pH值约为7.5时酶产率最高。pH值对微生物的发酵和生长起着关键的作用，通过改变其对营养物质的吸收能力来影响正常的生长代谢。纳豆芽孢杆菌生长最适pH值是7.0～7.5，过低或过高的pH值都将影响其正常的生长状态，导致酶产率下降。

2.6 培养时间对产酶的影响

分别添加麸皮10%，尿素2.5%，氧化钙2.5%，培养基加水量80mL，接种量9%，将苹果渣培养基置于37℃培养，每隔12h取样1次，测定NK酶产率，结果见图7。

图7 发酵时间对产酶的影响Fig.7 Effect of fermentation time on nattokinase yield

由图7可知，发酵时间对酶产率影响不大，36h酶产率最高。但考虑到生长周期越长，成本越大，也越容易滋生杂菌，发酵24h为合适的发酵时间。

2.7 响应面试验结果

根据单因素试验结果，选取对固态发酵影响较为显著的因素进行优化，设定尿素添加量在2%～3%之间，培养基加水量在60～100mL之间，氧化钙添加量在2%～3%之间，经软件Design Expert 7.0设计Box-Behnken响应面设计试验因素水平，试验结果见表1、2。

表1 Box-Behnken响应面设计试验因素水平和编码Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken experimental design

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix and experimental results

通过软件设计，分析可以得到优化后的响应值的动态参数方程：

2.7.1 回归分析

F检验反映的是回归模型的有效性，包括失拟性检验和回归方程显著性检验。t检验是对回归模型的系数进行显著性检验。由方差分析可见，该模型的P＝0.0006＜0.05，表明模型方程显著；失拟项在α＝0.05水平上不显著(P＝0.9359＞0.05)。该方程复相关系数的平方R2＝0.9558，说明建立的模型能理解响应值变化的95.58%，模型拟合程度较好，模型是合适的，能比较准确地描述苹果渣固态发酵中NK酶产率的变化规律。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression equation

从表3可见，A2、B2、C2对苹果渣固体发酵NK酶产率影响极显著(P＜0.01)；因素B、C对其影响显著，AB交互作用对其影响显著(P＜0.05)；AC、BC交互作用对其影响不显著(P＞0.05)。

2.7.2 各因素交互作用的响应面图和等高线图

图8 尿素添加量与培养基加水量交互作用对NK酶产率影响的响应面图和等高线图Fig.8 Response surface and contour plots describing the interactive effects of urea concentration and water amount on nattokinase yield

图9 尿素与氧化钙添加量交互作用对NK酶产率影响的响应面图和等高线图Fig.9 Response surface and contour plots describing the interactive effects of urea and calcium oxide concentrations on nattokinase yield

图10 培养基加水量与氧化钙添加量交互作用对NK酶产率影响的响应面图和等高线图Fig.10 Response surface and contour plots describing the interactive effects of water amount and calcium oxide concentration on nattokinase yield

从图8～10可以看出，交互作用对响应值的影响结果可直观反映出来，等高线的形状反映了交互作用的强弱，椭圆表示交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著[17]。在交互项对酶产率的影响中，尿素添加量与培养基加水量的交互作用较为显著。

2.7.3 回归模型的验证实验

经过软件Design Expert 7.0优化，分析得到最佳试验参数为尿素添加量2.58%、培养基加水量84.06mL、氧化钙添加量2.65%，进行验证实验，重复3次。在该条件下实际最大值为2150IU/g，与理论预测最大值2181.9IU/g基本相符，表明该模型具有很好的可靠性和重现性，从而也证明了响应面法优化的有效性。

3 结 论

本实验通过Box-Behnken响应面设计方法，对影响NK酶产率的尿素添加量、培养基加水量、氧化钙添加量3个因素进行研究，结果显示3因素对酶产率的影响作用是显著的。利用统计学方法建立了提高苹果渣发酵产NK酶产率的二次多项式模型，作为推测三因素以及三者的交互作用对菌种发酵产蛋白酶的适宜方法。确定最佳发酵条件为尿素添加量2.58%、培养基加水量84.06mL、氧化钙添加量2.65%，此条件下的纳豆激酶产率为2150IU/g，比单因素试验最高酶活1680IU/g提高了27.98%，结果证实是完全可行的，以廉价的工农业废料作为基本培养基获得了有较高酶活的产品，经济优势明显。

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Optimization of Fermentation Conditions for Nattokinase Production in Solid-state Fermentation by Bacillus subtilis Natto Using Apple Pomace as Substrate

CANG Yi-peng1，ZHANG Hong-zhi2，DONG Ming-sheng2,*
(1. Suqian Product Quality Supervision and Testing Institute, Suqian 223800, China；2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

TS201.1

A

1002-6630(2010)15-0181-06

2010-04-19

江苏省农业科技自主创新项目(CX(08)113)

仓义鹏(1974—)，男，硕士， 研究方向为食品质量与安全。E-mail：yipengcang@163.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：dongms@njau.edu.cn