蒋雪薇，罗晓明，盛灿梅，高必达

(1.湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410004)

米根霉L-乳酸发酵菌丝球形成条件的研究

蒋雪薇1,2，罗晓明2，盛灿梅2，高必达1,*

(1.湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410004)

研究米根霉CS323-9在摇瓶培养条件下影响菌丝成球及产乳酸的因素。考察(NH4)2SO4质量浓度、接种量、摇瓶转速及表面活性剂吐温-80用量4个因素，再利用L9(34)的正交试验，对菌丝球形成及产酸的条件进行优化。结果表明：(NH4)2SO4质量浓度4g/L、接种量7%、摇瓶转速200r/min、吐温-80用量0.5g/L时，摇瓶发酵菌丝球数目达115个/mL、菌丝球平均直径为1.2mm、L-乳酸积累量为78.9g/L。说明米根霉CS323-9在摇瓶培养条件下菌丝球的形成与乳酸的积累有较大的相关性。

米根霉；L-乳酸；菌丝球；正交试验

Abstract：The effects of (NH4)2SO4 concentration, inoculum size, shake flask agitation speed and quantity of Tween-80 on the growht of Rhizopus oryzae mycelial pellets for L-lactic acid production were studied using shake flasks. Based on orthogonal array optimization, ammonium sulfate concentration of 4 g/L, inoculum size of 7% (V/V), shake flask agitation speed of 200 r/min and quantity of Tween-80 of 0.5 g/L were found optimum. The quantity of mycelial pelletswas up to 115 per milliliter after culture for 48 under these conditions, the average pellet diameter 1.2 mm and the yield of L-lactic acid 78.9 g/L. Our findings suggest that the grwoth of Rhizopus oryzae mycelial pellets is largely correlated with L-lactic acid production.

Key words：Rhizopus oryzae；L-lactic acid；mycelial pellets；orthogonal array design

乳酸又名2-羟基丙酸(2-hydroxy propanoic acid)，是具有光学活性的最小分子之一，具有D-型、L-型和DL-型3种构型，能广泛应用于食品、医药和化学工业[1]。特别是近些年发现L-乳酸聚合形成的聚L-乳酸(PLA)具有可生物降解性以后，L-乳酸发酵呈现出巨大的应用前景[2-4]。米根霉因其能发酵积累高光学活性的L-乳酸而成为乳酸发酵的重要生产菌株。与细菌发酵不一样的是，米根霉是好氧发酵，需要有适当的溶解氧才能积累乳酸。而米根霉在液体深层发酵中的菌丝形态多数情况下是以大块菌丝团为主，这阻碍了氧的传递，对菌体的生物量及乳酸的积累都会有影响[5]。因此，研究发酵过程中菌体的形态变得尤为重要。

根霉在液体培养下菌体会呈现菌丝团块、菌丝和菌丝球等生长形态，这些复杂的生长形态不光影响发酵液中氧的溶解，还会使发酵控制变得比较复杂且不易掌握，难以建立合理的发酵动力学模型[6-7]。根霉在某些情况下会自聚集成球，这种生长状态有利于改善发酵液的流变学特性，能促进溶氧及菌体对营养物质的吸收和代谢，进而提高产酸。根霉在自聚集成球的状态下，其发酵动力学特性较菌丝体简单，便于模拟；另外，成球的根霉还有利于菌体的固定化，对研究固定化连续发酵生产L-乳酸具有极其重要的意义[8-10]。本实验研究米根霉摇瓶发酵中影响菌丝球形成的一些因素，对于乳酸液体深层发酵中如何改善菌丝形态有一定的参考意义。

1 材料与方法

1.1 菌种

米根霉(Rhizopus oryzae)CS323-9，由长沙理工大学微生物实验室提供。

1.2 培养基

斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基；麸皮培养基：麸皮按质量比1:1加水混匀后，取50g装入500mL的三角瓶；摇瓶培养基(g/L)：葡萄糖110、(NH4)2SO42、KH2PO40.6、MgSO40.25、ZnSO40.088、CaCO310，pH值自然。以上培养基均采用121℃、20min湿热灭菌；其中CaCO3在150℃、2h干热灭菌后加入。

斜面培养：28℃、2～3d；麸曲培养：28℃、7d，制备1012个/mL的孢子悬液作为接种物；摇瓶培养：250mL的三角瓶中装入50mL液体培养基，接种孢子悬液，28℃、160～240r/min培养48h。

1.3 分析方法[11]

还原糖：菲林滴定法；L-乳酸：EDTA定钙法；总酸：酸碱滴定法。

1.4 菌丝球的计数及球径的测定

采用计数器计出肉眼可见的菌丝球；随机取20个菌丝球，侧出球体的直径，然后求出平均值。

1.5 菌体生物量的测定

采用烘干法[11]。取一定量发酵液过滤得菌丝，蒸馏水充分洗涤除去菌丝上包裹的CaCO3，105℃烘至质量恒定并称量。

1.6 菌丝球形成及产酸条件的优化

在预试验基础上，选取对菌丝球形成及产酸影响较大的4个重要因素：(NH4)2SO4质量浓度、接种量、摇瓶转速、吐温-80用量为考察对象，开展单因素试验，单因素考察变量以外的其他条件为：(NH4)2SO42g/L、接种量6%(V/V)、摇瓶转速200r/min、吐温-80用量0g/L，28℃，培养48h。在此基础上采用L9(34)的正交设计，进一步考察各因素之间的协同作用，确定最佳菌丝成球及产酸条件，其因素水平表见表1。

表1 L9(34)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度的(NH4)2SO4对菌丝成球及产酸的影响

(NH4)2SO4是一种速效氮源，又是一种生理酸性盐，其被利用后培养的pH值会有所降低，而在微酸性条件下L-乳酸的积累水平较高，因此，以(NH4)2SO4作为氮源，有利于菌丝生长及L-乳酸积累[12]。故研究了不同质量浓度的(NH4)2SO4对米根霉CS323-9的菌丝成球及产酸的影响，结果见图1。

图1 不同(NH4)2SO4质量浓度对菌丝成球(a)和发酵指数(b)的影响Fig.1 Effect of (NH4)2SO4concentration on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

从图1a可以看出，随着(NH4)2SO4质量浓度的增大，菌丝球数目会出现较大的增幅，当(NH4)2SO4质量浓度达4g/L时，菌丝球数目达到最大，最后降为0(菌丝形成菌丝团块及絮状物，均计菌丝球数目为0)。

从图1b可知，当菌丝球数目达到最高值时，L-乳酸积累量也达到了较高水平，此时还原糖最低，同时生物量也达到较高的水平，但随着(NH4)2SO4质量浓度的进一步升高，在生物量保持较高水平时，总酸维持较高水平的同时L-乳酸的积累量却下降了。其原因可能与(NH4)2SO4是速效氮源，当质量浓度在一定的范围内增大时，有利于促进菌丝生长，孢子聚集成团时，先萌发的菌丝由于生长迅速，将后萌发的孢子包裹在菌丝团中，就形成菌丝球；当(NH4)2SO4质量浓度过大时，菌丝生长速度快且量多，故而容易形成菌丝团块，过大的菌丝团块会使其核心的菌丝在营养物质及溶氧的传递上出现困难，反而抑制了L-乳酸的积累，转为积累杂酸，致使乳酸产量急剧下降。因此，最佳的(NH4)2SO4质量浓度为4g/L。

2.2 不同接种量对菌丝成球及产酸的影响

图2 不同接种量对菌丝成球(a)和发酵指数(b)的影响Fig.2 Effect of inoculum size on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

由图2可知，接种量对菌丝球的形成及发酵周期都有很大影响[9]。接种量从5%增加到9%时，菌丝球数目及产酸到7%时同时达到最高。当接种量比较小时，菌丝球大而疏松，且菌丝球数少，当接种量为9%时，菌体大量生长，但菌丝球极小，仅肉眼能见，同时有大量的菌丝体存在，培养液呈现絮粥状，菌体与培养液很难分离；接种量为7%时，菌丝成球数最大，且球体致密均匀，生物量也最大。这主要是因为接种量低时，单位体积的孢子数目少，导致聚集的孢子团较少，形成的菌丝核心也就少，加之生成的菌丝量少，所以每个核心上缠绕的菌丝也就少，故最终菌丝成球数少；相反，适当提高接种量，形成的孢子团多，菌丝核心也多，每个核心上缠绕的菌丝相对来说比较多，因而形成均匀致密的菌丝球。接种量过大时，菌丝之间竞争生长空间[6]，则容易给成球造成干扰，反而使菌丝球数目减少。接种量为7%时，菌丝球数目最大且L-乳酸产生量最大，故最佳接种量为7%。

2.3 不同摇瓶转速对菌丝成球及产酸的影响

米根霉L-(+)-乳酸发酵属好氧发酵，为进一步考察菌丝成球及产酸与氧的需求的关系，研究了回旋式摇床在160～240r/min之间5种不同摇瓶转速对菌丝成球及产酸的影响，结果见图3。

由图3a可知，当转速小于200r/min时，随着转速的增加，其菌丝成球数略有增加。转速较低时，形成的菌丝球因自重而沉降，且菌丝球间相互交联，因而形成不规则的絮状菌丝带；当转速为200r/min时，菌丝成球数达最大值；当转速大于220r/min时，由于转速过大，大量菌丝互相缠绕，不利于成球，导致成球数相对于200r/min来说要少很多。

图3 不同摇瓶转速对菌丝成球(a)和发酵指数(b)的影响Fig.3 Effect of shake flask agitation speed on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

由图3b可知，当转速达到240r/min时，L-乳酸积累量急剧下降，总酸也略有降低，而还原糖则维持较高水平，同时生物量也处于较低水平。说明尽管米根霉L-(+)-乳酸发酵是好氧的，但不是通气量越大越好，通气过大一方面葡萄糖代谢旺盛，TCA循环加强，富马酸等代谢副产物增多[13]；另一方面会增加乳酸的氧化分解，产生其他副产物，导致总酸下降。因此，有利于菌丝成球及产酸的最佳转速为200r/min。

2.4 不同表面活性剂添加量对菌丝成球及产酸的影响

发酵液中适量添加表面活性剂可以改变发酵液流变学特性[7]。由前期实验发现非离子型表面活性剂吐温-80在培养过程中有利于改善菌丝的形态及产酸。故考察了添加不同量的吐温-80时，摇瓶发酵菌丝球形成及产酸的情况，结果见图4。

由图4可知，当吐温-80的添加量为1g/L时，菌丝球的数目达到最大，且产酸最高、还原糖最低，但当吐温-80的添加量进一步增加时(＞1g/L)，总酸及L-乳酸积累量下降较大，还原糖量较高且生物量也有所减少。这可能与吐温-80是非离子型表面活性剂，能改变发酵液中孢子和菌丝球液膜表面张力，可适度消除菌丝成团的障碍，有利于孢子和菌丝聚集成球；添加量较高时，容易导致孢子过多聚集，萌发时形成菌丝团块，而不易成球，致使发酵液流变学特性变化，不利于产物积累。因此，吐温-80的最佳添加量为1g/L。

图4 吐温-80的用量对菌丝成球(a)和发酵指数(b)的影响Fig.4 Effect of quantity of Tween-80 on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

2.5 正交试验确定最佳菌丝成球及产酸条件

以上研究了几个对菌丝成球影响较大的单一因素，但是，单因素试验不能很好地反映出各因素之间的相互作用关系，为进一步对米根霉CS323-9的菌丝成球及产酸条件进行优化，选用L9(34)的正交试验设计进行优化，结果见表2。

表2 L9(34)正交试验结果[8]Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

从表2可以看出，通过直观分析：各因素对L-乳酸积累量影响的主次顺序是D＞A＞C＞B；对于菌丝球数，其影响次序为D＞C＞B＞A。菌丝球数的结果差异相当大，尤其是试验号1、3、9，菌丝球的形成很少甚至没有，菌丝主要以团块或絮状物的形式存在。菌丝团块使菌丝内部的营养物质及氧的供给受到限制，菌丝生长仅局限于表面，使参与发酵的生物量减少，从而影响产物积累；而絮状菌丝在搅拌发酵过程中容易被打断，致使发酵液黏度升高，也会影响传质[14-15]。米根霉L-乳酸发酵对于营养物质及氧的传递比较敏感，条件控制不好时容易产生过多的乙醇、富马酸等副产物，影响L-乳酸的积累。而菌丝的形态直接影响了发酵液的流变学特性和发酵过程的传质效能，进而影响乳酸的生成和糖的消耗速率等重要发酵指标。因此，菌丝球数的多少与产酸有着较大的协同关系，可以看出，菌丝球数较少或没有的L-乳酸积累量也相对较低，而菌丝球数目较多的其L-乳酸的积累量也明显高于前者。基于丝状菌发酵中菌丝形态的变化对于发酵指标变化的重要影响，选取以菌丝球数为指标的分析结果确定其影响的主次顺序，其最佳条件组合为D2C2B2A2，即吐温-80用量0.5g/L、摇瓶转速200r/min、接种量7%、(NH4)2SO4质量浓度4g/L。

4个因素中表面活性剂吐温-80的用量无论是对于L-乳酸积累还是产物形成都有着较大的影响，这可能与吐温-80能有效改变发酵液的表面张力，从而改变溶氧及孢子聚集程度有关。影响L-乳酸积累量的第二因素是(NH4)2SO4质量浓度，这可能与(NH4)2SO4对菌丝生长有较大的影响有关，(NH4)2SO4质量浓度较高时，所获生物量也较高，L-乳酸是生长偶联型发酵，生物量较高时，L-乳酸积累量也随之提高；而影响菌丝成球的第二因素则是摇瓶转速，摇瓶转速对孢子萌发后不断延长的菌丝的缠绕形式有较大的影响，从而影响菌丝的形态。综合考虑，在生物量较大、菌丝成球数目较多时，L-乳酸积累量比较高，可以说，菌丝形态对于米根霉L-乳酸发酵来说也是一个非常重要的因素。

2.6 最优条件的验证实验

图5 试验号4(a)和最优化条件(b)实验的菌丝球形态Fig.5 Comparison of morphological pictures of Rhizopus oryzae mycelial pellets formed under different culture conditions: a. run 4 (see Table 2); b. ammonium sulfate concentration of 4 g/L, inoculum size of 7% (V/V), shake flask agitation speed of 200 r/min and quantity of Tween-80 of 0.5 g/L

以正交试验所得的最优化条件进行验证实验，摇瓶发酵平均产L-乳酸为78.9g/L，菌丝球生成数目为115个/mL，其菌丝球形态与正交试验4号试验组对比见图5。两组实验所得的产酸都比较高，且菌丝球形成数目也较高，从试验号4的照片(图5a)可以看出其菌丝球直径较大，平均达3.3mm，培养基中除菌丝球外还有少量絮状的菌丝体，而最优条件下的实验照片(图5b)则菌丝体较少，球的直径较小，平均为1.2mm，且菌丝球较4号致密，发酵液比较清稀，这样的培养液有利于营养物质及氧的传递，因而产酸有所提升。

3 结 论

3.1 研究了菌丝成球的影响因素，并探讨了菌丝成球与L-乳酸的积累关系，研究证明，菌丝球的形成有助于改善发酵液的流变学特性，有利于氧及营养物质的传递，从而有利于产酸。

3.2 促进菌丝球形成及摇瓶产酸的最佳条件：吐温-80用量0.5g/L、摇瓶转速200r/min、接种量7%、(NH4)2SO4质量浓度4g/L。其中吐温-80用量及摇瓶转速对菌丝球形成及产酸都有比较大的影响。在此条件下平均产酸达78.9g/L，菌丝球数目为115个/mL，球体平均直径为1.2mm。

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Effects of Culture Conditions of Mycelial Pellet Formation and L-Lactic Acid Production by Rhizopus oryzae

JIANG Xue-wei1,2，LUO Xiao-ming2，SHENG Can-mei2，GAO Bi-da1,*
(1. College of Bio-safety Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China；2. College of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410004, China)

TQ921.3

A

1002-6630(2010)15-0216-05

2010-05-07

湖南省教育厅资助项目(06C090)；微生物分子生物学湖南省重点实验室开放基金项目(MM0802)

蒋雪薇(1972—)，女，副教授，博士研究生，研究方向为工业微生物发酵及食品生物技术。E-mail：jxw_72@sina.com

*通信作者：高必达(1952—)，男，教授，博士，研究方向为应用微生物学。E-mail：bdgao@yahoo.com.cn