王琴丹，李柏林，欧 杰，罗 璟，严维凌，陈 平

(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海市食品研究所，上海 200235)

中式熟食咸鸡主要细菌的分离与初步鉴定

王琴丹1，李柏林1，欧 杰1，罗 璟1，严维凌2,*，陈 平2

(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海市食品研究所，上海 200235)

采用嗜冷菌选择性培养基和含盐选择性培养基对咸鸡微生物菌群进行分离筛选。根据细菌的菌落形态、革兰氏染色反应等常见特征，由嗜冷菌选择性培养基分离出6株菌C1～C6，含盐选择性培养基分离出4株NaCl胁迫条件下细菌S1～S4。提取单菌落DNA，对其16S rDNA序列进行PCR扩增后测序，结合形态、常规生理生化特性初步鉴定为：松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)C3，土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)C6，不动杆菌属(Acinetobacter sp.)C1、C2、C4、C5；日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)S1，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)S2、S3，假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)S4。

咸鸡；耐冷菌；NaCl 胁迫；分离；鉴定

Abstract ：Based on morphological identification and gram staining, 6 microbe strains, numbered C1 through C6, were isolated from Chinese-style cooked salted chicken using Psychrophiles selective medium and the use of nutrient agar medium containing 3% NaCl allowed isolation of 4 microbe strains, numbered S1 through S4. Single colonies were separated for 16S rDNA gene amplification and sequencing. Based on the results of morphological, physiological and biochemical studies, strain C3 was identified as Staphylococcus sciuri, C6 as Klebsiella terrigena, C1, C2, C4 and C5 as Acinetobacter sp, S1 as Enterobacter gergoviae,S2 and S3 as Staphylococcus epidermidis, and S4 as Bacillus pseudomycoides.

Key words：salted chicken；Psychrotrophs；salt stress；screening；identification

低温微生物是引起冷藏、冷冻食品变质的主要微生物，可分为嗜冷菌和耐冷菌两大类[1]。尽管低温微生物的发现距今已有100多年，由于实验条件的限制，相对中温微生物而言其研究还不够广泛和深入[2]。国外学者对嗜冷菌的研究开始较早，涉及食品、环境等多个方面[3-5]；我国亦有检测牛奶或奶粉中嗜冷菌的相关报道[6]；但对传统熟食，如咸鸡中低温微生物的研究却鲜有报道。Kushner[7]将盐生微生物分为6类，耐盐菌生长对氯化钠没有要求。早在上个世纪，Lefevre等[8]就开始了对嗜盐菌的研究，对中度嗜盐菌的研究较多[9]。国内外学者主要用传统的纯培养方法研究西式火腿、熏肉、烧烤等的致病菌，未能从分子生物学的角度进行分析，且关于中式传统熟食的嗜盐菌报道较少。咸鸡由于含盐量较高，形成了良好的耐盐菌生境，但可能由于嗜盐菌的存在不利于咸鸡的保鲜。

本研究利用分子生物学与纯培养的方法，对中式熟肉中主要微生物基因型和表现型两方面进行鉴定，了解特殊环境下细菌生长的相关特性，从而为熟肉产品生产设备的开发、生产工艺规范化、质量标准化提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 咸鸡样品采集

咸鸡由上海某公司生产，为鸡龄1年的淘汰鸡，每只质量约1kg，腌渍24h后盐水煮沸40min，捞出冷却后独立包装。咸鸡进一步分割和套聚乙烯(PE)包装，包装质量250g。置于5℃、相对湿度50%的恒温恒湿箱中贮藏，定时取样(均匀剪取鸡胸和鸡腿的表皮和肉、混合，并做3个平行)。

1.2 试剂与仪器

嗜冷菌选择性培养基用于低温微生物的分离和培养，由北京路桥技术有限责任公司提供；普通营养琼脂添加质量分数3.0% NaCl(每100g营养琼脂)，使之接近咸鸡的盐度，用于NaCl胁迫条件下细菌的分离和培养，由上海疾病预防控制中心提供；生理生化实验试剂由杭州天和有限公司提供。

PCR扩增试剂及扩增引物 上海生工生物工程技术服务有限公司；BSC12S1 Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒 Biospin公司；AG 22331 Hamburg普通PCR仪德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 咸鸡样品理化分析

水分含量：采用GB/T 9695.15—2008《肉与肉制品水分含量的测定》[10]；水分活度：采用GB/T 23490—2009《食品水分活度的测定》[11]；氯化钠含量：采用GB/T 9695.8—2008《肉与肉制品氯化钠含量测定》[12]；pH值：采用GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品pH测定》[13]。

1.3.2 菌种培养与分离

样品经系列稀释后涂布在嗜冷菌选择性培养基上，于(7±1)℃培养，7～10d后菌落计数[14]。挑取菌落表型差异的单菌落，纯化后将适于低温下生长的分离菌种转至嗜冷菌选择性培养基斜面，培养7d后于4℃保存。

样品经系列稀释后涂布在自制含盐选择性培养基上，于(37±1)℃培养，2d后菌落计数。挑取菌落表型差异的单菌落，纯化后将适于低温、3.0% NaCl胁迫下能够生长的分离菌种转至含盐选择性培养基斜面，培养2d后4℃保存。

1.3.3 单菌落DNA提取及16S rDNA的PCR扩增[15]

选用Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒直接提取单菌落DNA。以提取的基因组DNA为模板，选用细菌通用引物正向引物27f，反向引物1492r，选用25μL体系进行聚合酶链式PCR反应。

1.3.4 测序及比对

选择上海生工生物工程技术服务有限公司DNA柱式抽提试剂盒进行PCR产物的纯化，并由该公司进行测序。将该序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.3.5 咸鸡样品生理生化鉴定

参照东秀珠等[16]的《常见细菌系统鉴定手册》。

2 结果与分析

2.1 咸鸡样品理化分析

表1 咸鸡的理化性质Table 1 Physico-chemical properties of salted chicken breast and leg meat

2.2 嗜冷菌在5℃条件下的生长情况

前7d每8h定时取样，之后每6h定时取样进行菌落计数。5℃生长情况为细菌的培养时间提供了参考数据。实验发现，培养到第7天时两种菌都达到了对数期，因此确定嗜冷菌选择性培养基培养细菌的时间为7d。

图1 5℃条件下咸鸡细菌生长情况Fig.1 Growth curve of bacteria from salted chicken at 5 ℃ without the presence of NaCl

图2 5℃、3% NaCl胁迫条件下咸鸡细菌生长情况Fig.2 Growth curve of bacteria from salted chicken at 5℃ with the presence of NaCl

2.3 单菌落DNA的提取

图3 菌株的总DNA电泳图谱Fig.3 Electrophoretic analysis of total DNA from strains C1 through C6 and S1 through S4

将从活菌中提取的总DNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳，在23kb左右出现条带(图3)，表明已获得较为完整的微生物的全部基因组的DNA。

2.4 菌株的16S rDNA基因序列

对10株活化菌进行16S全长序列的PCR扩增，均能得到重复性好且稳定、清晰的特异条带，片段大约1500bp 左右(图 4)。

图4 菌株的16S rDNA电泳图谱Fig.4 Electrophoretic analysis of PCR amplification products of the 16S rDNA gene fragments from strains C1 through C6 and S1 through S4

2.5 测序及比对

表2 主要分离细菌常见生理生化鉴定Table 2 Morphological properties of strains C1 through C6 and S1 through S4

参照GenBank比对的结果，根据《常见细菌系统鉴定手册》作相应的生理生化实验(表2)，可得C3为葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)的松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)，C6为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)的土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)，C1、C2、C4、C5为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。S1为肠杆菌属(Enterobacter sp.)的日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)，S2、S3为葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，S4为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)。其中，由于不动杆菌生理生化鉴定涉及许多氨基酸实验，许多表型阳性反应不明显，且含有多个未命名的新种，本研究未能将其确定到种。

2.6 系统发育分析

将10株分离细菌所获得的16S rDNA序列提交NCBI，获得它们在GenBank数据库中的临时登录号C1～C6为：GQ899177～GQ899182，S1～S4为：GQ890463、GQ890464、GQ866975和GQ899176。通过Blast软件与GenBank中已发表的16S rDNA序列进行同源性比较，选取同源性在99%以上的细菌构建系统发育树。由图5可知，C1、C2、C4、C5与不同杆菌属Acinetobacter sp.(EU236748)亲缘关系最近；C3与葡萄球菌Staphylococcus sciuri(AB233331)的亲缘关系最近；S1与肠杆菌属Enterobacter sp.12(EU884439)的亲缘关系最近；S2、S3分别与葡萄球菌属Staphylococcus vitulinus(AM062694)和Staphylococcus carnosus strain 1708 (FJ795527)的亲缘关系最近；S4与芽孢杆菌属Bacillus cereus strain Y3(GQ462534)的亲缘关系最近。

图5 基于16S rDNA序列同源性的10株细菌系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of strains C1 through C6 and S1 through S4 based on the 16S rDNA sequences

2.7 细菌菌落特征

由表3可知，细菌特征观察结果与测序结果所对应的细菌一致，结合16S rDNA基因序列这一有效分子指标进行细菌分类的初步鉴定，可得到细菌所在的种。

3 讨 论

3.1 中式散装熟食的检测主要围绕菌落总数、大肠菌群和致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌)[17-18]进行，对一些特殊腐败菌的分析较少。分离纯化工作量大，时间长，对部分细菌的分类鉴定仍困难重重，而且只有不到1%的微生物是可以在实验室条件下培养的，绝大部分的微生物在目前条件下还未能培养[19-20]，因此对散装熟食的微生物污染状况了解的不够全面和透彻。

3.2 实验中未发现致病菌，分离出的10株活菌不排除属于同一个属，如C1、C2、C4、C5同属于不动杆菌属。有的鉴定为同一个种的菌株表型有可能不同，如S2、S3虽然鉴定结果都是表皮葡萄球菌，但S2的OF表型为阳性、S3为阴性；葡萄糖S2为阴性，而S3为阳性。可能与其比较特殊的生长环境有关，也有可能是某种尚未被发现的新种或亚种，有待进一步研究。

3.3 参照《伯杰细菌手册》[21]，葡萄球菌生长温度范围6.5～46℃，因此在7℃的培养温度下，仍能较好的生长；不动杆菌属和克雷伯氏菌属生长的最适温度范围分别为30～32℃和35～37℃，在7℃能够生长，可认为是耐冷菌或兼性嗜冷菌[2]。大部分细菌的最低水分活度值范围是0.90～0.99，嗜盐性细菌最低可达0.75，咸鸡的水分活度高达0.963，能够满足嗜盐菌生长要求；芽孢杆菌和肠杆菌的pH值适应范围都较广，pH6.3在其最佳pH值范围内，且两者的耐盐度较高，因而生长状况良好。嗜冷和含盐选择性培养基都分离得到了葡萄球菌，这与葡萄球菌属生长温度、pH值和耐盐范围广是一致的，与孙承峰等[22]在低温酱牛肉中分离得到葡萄球菌、肠杆菌等主要腐败菌的结果一致。

葡萄球菌、不动杆菌和克雷伯氏菌通常存在于食品、尘埃、土壤和水中，分布较广泛[21]。咸鸡经过蒸煮之后没有二次杀菌工艺，因此在冷却和包装的过程中可能污染上这些细菌。肠杆菌属在需氧生长中会产生过氧化氢，由于过氧化氢酶在熟制中被钝化，因而一些耐热的肠杆菌也能存活下来。另外，由于咸鸡中未添加亚硝酸盐等防腐剂抑制残存的细菌而可能造成食物的腐败，与南庆贤等[23]曾得到相同的结论。

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Screening and Preliminary Identification of Dominant Bacteria in Chinese-style Cooked Salted Chicken

WANG Qin-dan1，LI Bai-lin1，OU Jie1，LUO Jing1，YAN Wei-ling2,*，CHEN Ping2
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Shanghai Food Research Institute, Shanghai 200235, China)

TS201.3；TS251.6

A

1002-6630(2010)15-0212-04

2009-12-31

上海市科委应用技术专项资金开发项目(08-121)

王琴丹(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：wangqindan2005@163.com

*通信作者：严维凌(1967—)，男，高级工程师，本科，研究方向为农产品加工。E-mail：yanwling@hotmail.com