吴芳洁，杨文祥，骆伟，张金明，唐利军

(湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079)

研究报告

BALB/c－nu裸小鼠繁殖中杂合仔鼠剔除时间对纯合裸仔鼠生长发育的影响

吴芳洁，杨文祥，骆伟，张金明，唐利军

(湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079)

目的研究屏障设施下裸小鼠繁殖生产时，在不同时间段剔除杂合仔鼠对纯合裸仔鼠的成活率及生长发育情况的影响。方法选取25窝头胎生BALB/c－nu新生裸小鼠按剔除杂合仔鼠的时间不同分成五组，以24 h剔除组为对照比较纯合裸仔鼠生长发育及死亡率、离乳率的差异性，统计分析其生长发育过程中的体重增长等。结果剔除组生长发育及死亡率与对照组之间均存在差异性，其中14 d剔除组和21 d剔除组差异极显著。结论剔除杂合仔鼠的时间对纯合裸仔鼠的成活率及生长发育情况的有很大影响。为了保证SPF级裸鼠生长发育要求，生产繁殖出合格的实验用裸小鼠，剔除全部杂合仔鼠的最佳时间应该在新生仔鼠出生24 h内，超过3 d则会极大地影响纯合裸小鼠的正常生长发育。

裸小鼠;繁殖;杂合仔鼠;纯合仔鼠;剔除

无胸腺裸鼠的T淋巴细胞缺损，免疫机能低下，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植，因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体，作肿瘤药物治疗和肿瘤免疫的研究，同时也是研究病毒、细菌、寄生虫、微生物感染机制及生物制品和药品检定的极好模型动物，广泛应用于肿瘤学、免疫学、毒理学等基础医学和临床医学的研究。目前，我国动物实验对裸鼠的需求量逐年增加，常用裸小鼠品系有:BALB/c－nu、NIH－nu、NC－nu、Swiss－nu、C3H－nu、C57BL－nu等［1］。

裸鼠的饲养和繁殖要求条件比较严格，我国已有这方面的经验报道。繁育方式均采用♂nu/nu×♀nu/+，后代个体均有纯合体“nu/nu”(无毛)和杂合体“nu/+”(有毛)之分，比例接近1∶1。只有无胸腺纯合裸鼠(nu/nu)才符合实验用要求，杂合子裸小鼠(nu/+)仅部分胎次雌性可供留种，其余无经济价值，但其个体强壮，抢乳力强，哺乳期内在一定程度上会影响纯合子裸小鼠的生长，使其体质羸弱瘦小，甚至死亡。因此，在日常裸鼠生产繁殖工作中新生杂合子裸小鼠除需要保留少量雌鼠留种外，其余都应尽快剔除淘汰，以保证纯合裸仔鼠无抢奶对手，满足纯合裸鼠的生长需要。但是因为新生乳鼠不易辨别，文献资料及相关理论书籍中也没有明确的硬性规定指出杂合仔鼠的剔除时间，很多饲养员并没有在第一时间将杂合仔鼠淘汰，而是等杂合仔鼠体表长出肉眼可见的小绒毛(7 d)后才剔除，甚至等离乳时(21 d)才分别饲养。而根据笔者多年饲养观察发现，同日龄的纯合裸仔鼠相比较，早剔除杂合仔鼠的会比晚剔除的成活率高，其21 d分窝时的体重也有很大区别。

为了证实笔者观点，寻找出剔除杂合仔鼠的最佳时间，观察剔除时间对裸鼠的生长发育及成活率的影响，特选取25窝头胎生BALB/c－nu新生裸小鼠按剔除杂合仔鼠的不同时间分成五组，比较纯合裸小鼠生长发育及死亡率的差异性，其数据结果可供有关科研人员参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:25窝SPF级BALB/c－nu新生裸小鼠，所配雄性鼠为纯合(nu/nu)雄鼠，母鼠为杂合(nu/+)雌鼠，均为初配，所生仔鼠同为头胎。全部25只孕鼠产仔日期间隔在2d以内。来源于湖北省实验动物研究中心【SCXK(鄂)2008－0005】。本实验在湖北省实验动物研究中心SPF级屏障动物实验设施进行【SYXK(鄂)2008－0014】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 饲养条件:屏障系统为初、中、高三级过滤结构，10 000(万)级空气净化饲养室。内置层流柜(JD－25洁净层流柜，由苏州实验动物器材厂生产)。空气经初中高效过滤器过滤后送入层流柜。洁净等级为100级，风速大于﹥0.2m/s。

1.1.3 实验环境:溴化锂吸收式冷温水机组24 h控温，温度区间为22～26℃;相对湿度:50%～70%;噪音:＜60 dB。

1.1.4 饲料、饮水、垫料:饲料营养成份均按国家标准执行，由湖北省实验动物研究中心提供，均经过高压蒸汽灭菌消毒;饮水经杭州永洁达净化科技有限公司生产的实验动物饮用水处理器过滤净化;垫料为高压蒸汽灭菌刨花。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理:将25窝新生鼠随机分为5组，每组在不同时间将杂合仔鼠全部剔除，仅留纯合裸仔鼠哺乳。设24h内剔除杂合仔鼠(nu/+)组;3d剔除杂合仔鼠(nu/+)组;7d剔除杂合仔鼠(nu/+)组;14d剔除杂合仔鼠(nu/+)组;21 d离乳不剔除组。21 d时各组仔鼠全部离乳。

孕鼠生产后，新生仔鼠可根据无鼻毛或有少量卷曲鼻毛的特征作为辨认是否为纯合子的依据。无鼻毛或有少量卷曲鼻毛的为纯合子裸鼠(nu/nu);鼻毛浓密且胡须笔直外展的为杂合仔鼠(nu/+)［2］。出生后即可辨别。每组按以上特征在不同时间剔除新生杂合仔鼠，纯合裸鼠全部保留。如实记录各窝产仔数、死亡率、各期体重等生长发育情况。

2 结果

2.1 裸鼠繁殖性能及离乳率

实验各组平均产仔数相比差异无显著性(P＞0.05)。平均产裸仔数各组相比差异无显著性(P＞0.05)。而与24h剔除组相比较，裸仔死亡数、裸鼠离乳育成率3d剔除组差异无显著性(P＞0.05)，7d剔除组差异显著(P＜0.05)、14 d、21 d剔除组差异极显著(P＜0.01)见表1。

2.2 平均体重增长情况

在本实验中，各组杂合仔鼠和纯合裸仔鼠生长发育情况有相当大的差异。与24 h剔除组相比较，纯合裸仔鼠初重及3 d体重各组差异均无显著性(P＞0.05)。7 d体重3、7、14、21 d剔除组差异有显著性(P＜0.05)。2周体重7、14、21 d剔除组雌性差异均有显著性(P＜0.01)，雄性7 d剔除组差异有显著性(P＜0.05)，4 d、21 d剔除组差异有显著性(P＜0.01)。3周体重7 d剔除组差异有显著性(P＜0.05)，4 d、21 d剔除组差异有显著性(P＜0.01)。4周体重3 d、7 d剔除组差异有显著性(P＜0.05)，14 d、21 d剔除组差异有显著性(P＜0.01)。见表2。

表1 裸鼠繁殖性能、纯合裸仔鼠成活情况及离乳率比较Tab.1 Comparison of the reproductive performance of nude mice，the survival and weaning rate of homozygous offsprings

表2 各组纯合(杂合)裸仔鼠平均体重增长表(±s，g)Tab.2 The average weight gain of homozygous nude mouse(The heterozygous)offsprings in each group(±s，g)

表2 各组纯合(杂合)裸仔鼠平均体重增长表(±s，g)Tab.2 The average weight gain of homozygous nude mouse(The heterozygous)offsprings in each group(±s，g)

注:*表明与24 h剔除组相比较差异有显著性(P＜0.05)，**表明与24 h剔除组相比较差异有显著性(P＜0.01)。Note:*Indicates a significant difference compared with that of 24 h－removal group(P＜0.05)，**indicate a very significant difference compared with that of 24 h－removal group(P＜0.01).

组别Group初重Initial weight 3 d 3 d－weight 7 d 7 d－weight 2周2 w－weight 3周3 w－weight 4周4 w－weight雌性Famale 24 h剔除组24 h－removal group 1.0±0.1 2.3±0.1 5.0±0.7 7.3±0.2 10.0±0.8 12.2±0.9 (0.9±0.3)－－－－－3 d剔除组3 d－removal group 1.0±0.4 2.2±0.3 3.8±1.1*7.0±0.4 9.8±1.0 10.5±1.2*(1.2±0.4)(2.4±0.3*)－－－－7 d剔除组7 d－removal group 0.9±0.5 2.0±0.7 3.8±0.7*5.8±0.7**8.5±0.7*9.1±0.7*(0.9±0.7)(2.2±0.3*)(5.8±0.4*)－－－14d剔除组14 d－removal group 1.1±0.2 2.1±0.5 3.3±2.4*4.5±2.1**6.5±3.1**7.3±0.7**(1.0±0.4*)(2.4±0.6*)(5.1±2.0*)(7.6±2.1*)－－21 d离乳组21 d－weaning group 1.2±0.4 2.1±0.4 3.5±2.1*4.1±1.1**6.0±2.8**6.5±3.3**(1.1±0.2)(2.3±0.4*)(5.3±0.9*)(6.9±2.3**)(9.0±2.5**)(13.8±2.3**)雄性Male 24 h剔除组24 h－removal group 1.3±0.5 2.5±0.1 5.4±0.3 7.6±0.3 10.2±0.7 13.6±0.5 (1.1±0.4)－－－－－3 d剔除组3 d－removal group 1.2±0.6 2.3±0.4 4.7±0.9 6.6±0.7 10.5±1.2 14.5±0.7 (1.2±0.6)(2.6±0.5*)－－－－7 d剔除组7 d－removal group 1.1±0.3 2.4±0.8 4.0±0.7*5.8±1.4*8.5±1.8*9.6±0.7*(1.1±0.3)(2.4±0.7*)(6.1±1.0**)－－－14 d剔除组14 d－removal group 1.3±0.3 2.4±0.7 3.8±1.5*4.5±0.7**6.5±2.8**7.5±3.0**(1.3±0.3)(2.7±0.9*)(5.9±1.7**)(8.0±0.9**)－－21 d离乳组21 d－removal group 1.2±0.4 2.2±0.3 3.6±2.0*4.5±1.0**5.8±2.9**7.9±2.7**(1.2±0.4)(2.5±0.6*)(6.4±0.8**)(8.5±1.4**)(11.2±2.1**)(14.2±2.7**)

并且，杂合仔鼠的体重与纯合裸仔鼠的体重同期有较大区别，3 d体重差异有显著性(P＜0.05)，7 d之后体重相比较差异有显著性(P＜0.01)。见表2。

由21 d离乳组仔鼠生长曲线图可见，同期的杂合子生长发育情况明显好于纯合裸仔鼠，纯合裸仔鼠的生长曲线平缓无峰，与杂合仔鼠曲线差距明显，其体重增长缓慢，表现出明显营养不良、生长发育迟缓的症状。见图1。

图1 21 d离乳组杂合仔鼠与纯合裸仔鼠平均体重增长对照表Fig.1 comparison of the average body weight of weaning heterozygous and homozygous offsprings in 21 days

3 讨论

裸鼠独特的生产繁殖方式决定了其乳鼠中杂合子、纯合子并存的状态，本实验证明为了保证裸小鼠的生长发育要求，人工剔除杂合子是非常必要的，并且有时间要求。分析实验数据并结合长期裸小鼠的生产繁殖工作，笔者得出如下几点结论:

3.1 杂合仔鼠抢奶能力非常强，应在第一时间剔除

杂合仔鼠(nu/+)其个体天生强壮，抢乳能力非常强，在哺乳期会严重影响裸小鼠的生长发育。裸仔鼠体格弱小，如果没有充足奶源供给，必然导致发育不良，在哺乳期中容易死亡。由本实验可见，24 h内剔除杂合子的纯合裸小鼠体格发育健康，除天生体弱有个别死亡外，其余均生长正常。而哺乳中晚期剔除组，几乎每窝均有裸鼠死亡，甚至个别窝裸鼠全部死亡。就算有一些瘦弱裸鼠存活至离乳，其体重也明显低于正常水平，其外观体态典型营养不良，后期发育非常迟缓，明显低于正常标准，寿命也较正常裸鼠短，根本不能作为科学实验的供体，失去了科研价值。因此，剔除杂合仔鼠对纯合裸鼠的成活率有较大影响，在3 d内尽早剔除非常必要。

根据资料记载，一般裸仔鼠从初生到离乳，是体重增长最为迅速的一个过程，呈直线上升趋势。到3周龄离乳时，已超过初生体重的7倍以上，但体重增长速度在雌雄不同性别水平上差异表现不显著［2］。而由实验结果可知，出生3 d后和杂合仔鼠一同哺乳的裸仔鼠，体重增长缓慢，7 d后便显现明显营养不良症状。因此笔者认为剔除杂合仔鼠的时间最好在出生24 h内，绝不可超过出生后3 d，否则将严重影响裸小鼠生长发育。对此，裸鼠饲养人员应该提高自身专业能力，多练习辨别杂合子与纯合子裸小鼠，保证在新生鼠24 h内准确快速的进行剔除工作，同时做到不惊吓生产母鼠，以免发生食仔、停乳现象。

3.2 杂合仔鼠留种也应尽量找代乳母鼠或无裸仔鼠母鼠集中哺乳

杂合子对纯合裸小鼠生长发育影响大，在需要杂合子雌性留种时，也最好不要同窝留种，即不要杂合子与纯合子一起哺乳，而应该分开。杂合子体格强壮，适应力强，最好为其找代乳母鼠集中哺乳，一只母鼠最多可带10只杂合仔鼠。需要注意的是，哺乳期母鼠会根据气味认仔，对非亲生仔鼠往往会食仔。因此，代乳母鼠最好为护仔性强、无食仔史的青壮年经产鼠，并在同窝前不要换窝，先将母鼠提出，将仔鼠放入窝中滚上垫料，沾染其亲生鼠和母鼠粪便气味，几分钟后再将母鼠放回窝中，能有效避免食仔。如果找BALB/c或KM小鼠等不同种母鼠代乳，则要将其亲生仔鼠剔除以免混淆。

值得注意的是，杂合仔鼠的影响仅是保证裸仔鼠的生长发育的一个方面，还有母鼠胎次、生产只数、哺乳期营养、哺乳期环境等诸多因素可影响裸仔鼠的正常发育，或造成其死亡，在今后的研究中，笔者将会进一步探讨。

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Im pact of Rem oval Tim e of Heterozygous O ffsp rings on the G row th and Developm ent of Hom ozygous O ffsp rings in BALB/c-nu Nude M ouse Breeding

WU Fang－jie，YANG Wen－xiang，LUO Wei，ZHANG Jin－ming，TANG Li－jun

(Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention，Wuhan 430079，China)

ObjectiveIn order to study the impact of various removal times of heterozygous offsprings on the survival rate，growth and development of the homozygous offsprings of nude m ice in barrier breeding facilities of nude mice production.M ethods 25 farrows BALB/c－nu offspring mice were selected，and divided into 5 groups according to different removal times of heterozygous offspring.The grow th and development，weaning rate were recorded and statistical analysis of body weight was performed.Results The growth and mortality of the four groups showed significant difference compared with that of the control group(P＜0.05)，among them，the 14d－and 21d－removal groups showed a very significant difference(P＜0.01).ConlusionVarious times of removing heterozygous nude mouse offsprings have a strong impact on the survival rate，growth and development of the homozygous nude mouse offsprings.In order to meet the grow th and development requirements of SPF nude mice，we suggest to remove all heterozygous nude mouse offsprings within 24 hours after the birth of neonates.Removal of heterozygous nude mouse offsprings at 3 days or later will have considerable influence on the normal grow th and development of homozygous nude mouse offsprings.The data of this study may provide useful reference for researches in this field.

Nude mice;Breeding;Removal;Hheterozygous offspring;Homozygous offsprings

Q95－331

A

1005－4847(2010)02－000－0

2009－07－22

吴芳洁(1982－)，女，助理兽医师，从事实验动物生产管理工作。

唐利军，男，研究员，湖北省疾病预防控制中心卫生毒理首席专家，从事卫生管理工作。