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17β-雌二醇对去卵巢大鼠子宫β-连环素和E-钙粘素蛋白表达的影响

2010-09-09陈永杰卜淑敏沈红

中国实验动物学报 2010年2期
关键词:雌二醇细胞膜卵巢

陈永杰,卜淑敏,沈红

(1.北京农学院动物科学系,北京 102206;2.首都体育学院,北京 100080)

研究报告

17β-雌二醇对去卵巢大鼠子宫β-连环素和E-钙粘素蛋白表达的影响

陈永杰1,卜淑敏2,沈红1

(1.北京农学院动物科学系,北京 102206;2.首都体育学院,北京 100080)

目的旨在研究17β-雌二醇对去卵巢大鼠子宫β-连环素(β-catenin)和E-钙粘素(E-cadherin)蛋白表达的影响。方法将30只健康3月龄雌性SD大鼠,随机分为假手术组、去卵巢组、去卵巢和雌激素给药组。大鼠去卵巢1周后,给药组大鼠颈部皮下注射17β-雌二醇,每周3次,每次50 μg/(kg·bw),连续给药10周。采用放免法、免疫组化法和Western blot方法分别检测大鼠血清E2水平、子宫β-catenin和E-cadherin蛋白的免疫定位和表达。结果大鼠去卵巢后子宫指数和血清E2水平显著下降,但大鼠补充外源性17β-雌二醇后,上述两项指标均显著回升且与假手术组相比无显著差异。免疫组化检测发现,假手术组和去卵巢组大鼠子宫内膜的细胞膜上有β-catenin和E-cadherin蛋白表达,而雌激素给药组大鼠子宫内膜细胞膜和细胞核上都有E-cadherin表达。Western blotting结果进一步显示,去卵巢组大鼠子宫β-catenin和E-cadherin蛋白表达量极显著低于假手术组和雌激素给药组。结论17β-雌二醇不仅能使E-cadherin蛋白在去卵巢大鼠子宫细胞中的免疫定位发生变化,而且还能刺激βcatenin和E-cadherin蛋白的表达。

雌二醇;去卵巢大鼠;β-连环素;E-钙粘素

女性在绝经期由于卵巢功能衰退易出现肥胖、脂肪肝、冠心病、高血压、糖尿病、骨质疏松症等疾病,称为绝经期综合征。绝经期综合征是困扰当今社会的一大医学问题,目前临床上常用雌激素替代疗法(HRT),即通过直接补充雌激素(estrogen,E2)来治疗此病症。该法虽然疗效确切,但如果长期服用,会出现较大的副作用,如增加阴道出血和促进生殖系统肿瘤发生等[1],无法在临床上广泛应用和推广。E2对子宫内膜增殖作用及致肿瘤作用的确切机制目前还不清楚,揭示E2介导的肿瘤发生途径,有助于从根本上解决E2的潜在致癌作用。E-钙粘素(E-cadherin)是一种Ca2+依赖性细胞粘附分子,广泛分布于上皮细胞,是维持上皮细胞极性及细胞间粘附、连接的主要分子。β-连环素(β-catenin)是细胞骨架蛋白和Wnt信号通路转导分子之一,在细胞连接处它与E-cadherin结合形成E-cad-cat复合体相互作用,参与细胞粘附,维持上皮细胞的正常形态,而游离的β-catenin可进入细胞核,调节基因表达[2,3]。许多研究表明,肿瘤的发生发展过程中常常伴有异常Wnt信号的激活,E-cadherin表达异常常与肿瘤的发生、转移及预后有关[4]。为此,本实验采用国内外通用的模拟绝经后综合征的去卵巢大鼠模型[5],检测了补充外源性17β-雌二醇对去卵巢大鼠子宫β-catenin和E-cadherin蛋白表达的影响,旨在为探讨绝经后妇女长期服用E2继发子宫内膜癌的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

17 β-estradiol(E2,Sigma E 2758-5G),多聚甲醛(Merck,德国),石蜡(上海华永石蜡有限公司),兔源β-catenin多克隆抗体(RB-1491-P0 NeoMarkers Biotechnology,Fremont,)、兔源E-cadherin多克隆抗体(H-108,SC-7870),生物素标记的山羊抗兔二抗、辣根酶标记卵磷蛋白素、山羊抗兔IgG/碱磷酶标记抗体(ZB-2308中杉金桥生物技术有限公司)、rabbit-anti-actin(SC-1616R中杉金桥生物技术有限公司),DAB显色试剂盒和碱磷酶底物BCIP/NBT显色浓缩液(中杉金桥生物技术有限公司),橄榄油(PONS),E2试剂盒(中国原子能科学研究院), RIPA蛋白裂解液(P0013B碧云天),SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015碧云天)。Leica切片机(Leica,德国),显微镜(Olympus BX51),电泳仪(DYY-7C型北京六一仪器厂)。

1.2 实验动物分组和处理

三月龄未经产Sprague Daw ley雌性大鼠30只,体重(230±15)g,购自并饲养在维通利华实验动物有限公司[SCXK(京)2006-0008]。大鼠在通风无菌环境下自由采食与饮水,饲养7d后,按体重随机分为假手术组(Sham)、去卵巢组(OVX)和E2给药组(OVX+E2),每组10只动物。去卵巢和E2给药两组大鼠均摘除双侧卵巢,假手术组仅切除卵巢附近少许脂肪。无菌手术在北京大学医学部实验动物科学部进行[SYXK(京)2006-0025],并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。手术1周后,E2组大鼠每周按体重颈部皮下注射3次17 β-雌二醇,每次50 μg/(kg·bw),连续注射10周。每周称一次体重,按体重调整给药剂量,假手术和去卵巢组大鼠同时给予相同体积的溶剂(无水乙醇和橄榄油)。

1.3 取材

实验结束时,大鼠禁食12 h,按体重腹腔注射水合氯醛(0.1 m l/kg)麻醉,腹主动脉取血后处死,剪开腹腔,游离子宫,仔细剪去子宫周围脂肪组织,称重,计为子宫湿重,子宫指数=子宫湿重(mg)/体重(g)。迅速将左侧子宫投入4%多聚甲醛溶液中固定,将右侧子宫液氮冻存以备蛋白提取。

1.4 血清E2含量的测定

常规方法制备血清后,-40℃保存。用放射免疫法测定大鼠血清E2含量,实验操作按照试剂盒说明书进行。

1.5 免疫组织化学分析

子宫石蜡连续切片(5 μm)经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水、抗原修复、3%双氧水处理后,用山羊血清封闭1 h,加一抗(β-catenin,E-cadherin),4℃过夜;PBS洗3次,每次5 min;加生物素标记的山羊抗兔IgG室温孵育2 h,PBS洗3次,每次5 m in,加辣根酶标记卵磷蛋白素室温孵育2 h,PBS洗3次,每次5 min,DAB显色。切片经苏木精复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片后,Olympus显微镜下观察拍照。

1.6 W estern b lotting测定分析

取200 mg子宫组织在液氮中研成粉末,加入1 m L组织裂解液,研磨后静置于冰上2 h,4℃12 000 r/m in离心30 m in,取上清,留一部分检测蛋白质浓度,其余蛋白样品与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀,沸水煮5 m in,分装后-40℃保存。

取蛋白样品40 μg,上样,以80 V电压,在10%的SDS-PAGE中分离约2 h后,以80 V电压2 h,转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h,PVDF膜用一抗(β-catenin,E-cadherin,β-actin)孵育4℃过夜,次日,室温作用2 h,加二抗(山羊抗兔Ig/ G碱磷酶标记)室温孵育2 h,碱磷酶底物BCIP/ NBT显色浓缩液作用PVDF膜显色直至条带出现,放入水中终止显色,扫描各条带灰度。

1.7 数据分析

采用SPSS16.0统计软件处理数据,实验结果以平均数±标准差(±s)表示,组间差异显著性采用方差分析的LSD(ONE WAY-ANOVA)。

2 结果

2.1 大鼠子宫重量及子宫指数的分析

各组大鼠子宫湿重和子宫指数统计分析结果见图1。由图1可知,去卵巢组大鼠子宫湿重和子宫指数极显著低于假手术组和E2组(P<0.01),E2组大鼠子宫湿重显著低于假手术组(P<0.05),但两组大鼠子宫指数差异无显著性。

图1 各组大鼠子宫湿重和子宫指数的分析Fig.1 Analysis of the uterus wet weight and uterus index of the rats in different groups

2.2 大鼠血清E2含量的分析

3组大鼠血清E2测量结果见图2,与假手术组相比,去卵巢大鼠血清E2含量极显著下降(P<0.01),E2给药10周后,E2组大鼠血清E2含量极显著升高(P<0.01),与假手术组相比没有显著性差异。

2.3 大鼠子宫β-catenin蛋白的表达

采用免疫组化法检测β-catenin蛋白在大鼠子宫中的表达,结果见图3(彩插5)。由图3可见,各组大鼠子宫内膜腔上皮、腺上皮、间质以及肌层中均有棕色β-catenin阳性表达产物,其中假手术组和去卵巢组大鼠子宫内膜细胞膜棕色明显,细胞核呈蓝色,没有β-catenin蛋白表达;而E2组大鼠子宫内膜细胞膜和细胞质棕色均增强,细胞核蓝色变浅并稍有棕色,说明β-catenin蛋白在细胞核也有表达(图3h和i)。

Western blotting结果进一步显示(图4),去卵巢组大鼠子宫β-catenin蛋白表达量比假手术组极明显降低(P<0.01),而E2组大鼠子宫β-catenin表达量比去卵巢组极显著增加(P<0.01),且与假手术组没有显著差异。

图2 各组大鼠血清E2含量的分析(**P<0.01)Fig.2 Analysis of serum E2concentration of the rats in different groups

2.4 大鼠子宫E-cadherin蛋白的表达

图4 大鼠子宫β-catenin和内参β-actin的免疫印迹结果(A)和蛋白的相对表达水平(B)(**P<0.01)Fig.4 The results of Western blotting of β-catenin and β-actin protein(A)and the relative expression levels of β-catenin(B)and β-catenin protein(B)in the rat uterine tissue

E-cadherin蛋白在大鼠子宫的免疫定位结果如图5(彩插5)所示。由图5可见,棕色为阳性表达产物,假手术组中,E-cadherin蛋白主要在子宫内膜腺上皮和腔上皮的细胞膜上表达,细胞核中不表达,基质细胞中只有背景水平的表达。E2组中,E-cadherin在基质和肌层中的表达增强,且定位发生变化,不仅细胞膜表达,细胞核也有表达(图5h和i)。

Western blotting结果进一步显示(如图6所示),去卵巢组大鼠子宫E-cadherin蛋白表达量极显著低于假手术组(P<0.01),而E2组大鼠子宫E-cadherin蛋白表达量比去卵巢组明显升高(P<0.01),与假手术组没有显著差异。

图6 大鼠子宫E-cadherin和内参β-actin的免疫印迹结果(A)和E-cadherin蛋白的相对表达水平(B) (**P<0.01)Fig.6 The results of Western blotting of E-cadherin and β-actin proteins(A)and relative expression level of E-cadherin(B)in the rat uterine tissue.

3 讨论

E2被广泛用于防治绝经期综合征,但长期持续E2作用可增加患子宫内膜癌的风险。去卵巢动物模型是一种能够较好地模拟人类因E2不足而导致绝经期综合征发生的动物模型。本实验中,大鼠去卵巢后血清E2水平和子宫指数均显著下降,补充外源性E2后,血清E2水平和子宫指数明显回升且接近假手术组,提示本实验补充的外源性E2接近大鼠的生理剂量,能使子宫指数几乎恢复至正常水平。推测本实验采用的E2注射剂量应该不会导致去卵巢大鼠子宫内膜癌的发生。

β-catenin有双重作用,一方面作为Wnt/βcatenin信号通路的关键分子,游离在细胞质,当有Wnt信号时,β-catenin不能被降解复合物(APCGSK3β-Axin)及时降解,使胞质游离β-catenin水平升高,并转运到细胞核里与Tcf结合时,调节靶癌基因c-myc过度表达,导致细胞癌变[6]。另一方面,βcatenin在细胞膜上能与E-cadherin结合形成E-cadcat复合体,发挥细胞粘附作用,当E-cadherin突变时,可能使细胞质中游离的β-catenin水平升高,激活靶基因(如致癌基因等)[7]。

Hou等[8]研究认为Wnt/β-catenin信号通路在E2介导的子宫生长中起关键作用,是E2发挥ER非依赖性效应的主要作用途径,E2通过上调Wnt信号通路中Wnt4,Wnt5a和Fz2几个分子的表达,启动Wnt/β-catenin信号通路,使β-catenin迅速聚积到核里,启动下游基因表达。谢伟等[9]在体外观察了E2对子宫内膜异位症患者的子宫内膜间质细胞βcatenin表达的影响,发现E2能剂量和时间依赖性地促进子宫内膜间质细胞β-catenin mRNA和蛋白的表达。本实验中,E2能够使去卵巢大鼠子宫部分β-catenin蛋白内聚到腔上皮和腺上皮细胞的细胞质和细胞核中,提示β-catenin可能参与E2调节子宫腔上皮和腺上皮增殖的过程,此结果与Hou等的结果相符。Western bolt结果进一步显示去卵巢后β-catenin蛋白表达显著降低,给予雌激素治疗后,与去卵巢组相比β-catenin蛋白表达显著升高,表明E2能上调去卵巢大鼠子宫β-catenin蛋白的表达。说明能E2可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路而持续刺激子宫内膜的增殖。

E-cadherin是表达于所有正常上皮组织细胞膜上的一种代表性钙粘附素分子,属于钙依赖性跨膜糖蛋白,主要介导细胞间同质粘附,维持上皮细胞形态结构完整性和极性。近年来在肿瘤细胞侵袭和转移研究中发现,肿瘤细胞必须首先从邻近的肿瘤细胞中分离,再侵入周围组织,因此,细胞间粘附的丧失是肿瘤侵袭、发展和转移的关键步骤之一[10]。E-cadherin的功能障碍或缺失会使肿瘤细胞间的连接减弱,瘤细胞易于从母体脱离,发生转移;研究发现E-cadherin的表达程度与多种恶性肿瘤的肿瘤临床分级呈负相关,E-cadherin表达下调或缺失预示肿瘤转移及预后不良[11]。本实验结果表明E2能使E-cadherin在子宫内膜的表达出现定位变化,由细胞膜转移至细胞核,说明补充E2使E-cadherin失去正常膜定位,导致细胞粘附功能降低或消失。Western blotting结果进一步显示,去卵巢大鼠子宫E-cadherin蛋白表达显著降低,但补充E2后E-cadherin蛋白表达显著升高,提示E2能上调去卵巢大鼠子宫E-cadherin蛋白的表达。

正常情况下β-catenin与E-cadherin的结合会增加其在细胞质中的稳定性而避免被水解,同时也使β-catenin呈现稳定的膜表达,当E-cadherin表达下降或缺失时,β-catenin便会在胞质内积累,Wnt信号通路激活的阈值随之下调;反之E-cadherin在细胞膜上的稳定在一定程度上也依赖于与β-catenin的结合[12],β-catenin与E-cadherin两者相互影响,与肿瘤发生、发展关系密切。长期持续无孕激素拮抗的高E2作用可能激活Wnt信号通路,使细胞膜上的β-catenin进入细胞核内,激活靶基因转录,使子宫不断的处于增殖中,同时引起E-cadherin的表达异常,导致细胞粘附功能降低或消失,有可能进一步引起肿瘤的发生。

17β-雌二醇不仅能使E-cadherin蛋白在去卵巢大鼠子宫细胞中的免疫定位发生变化,而且还能刺激β-catenin和E-cadherin蛋白的表达。

(本文图3,5见彩插5。)

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Effects of 17β-Estradiol on the Exp ression of β-Catenin and E-Cadherin Proteins in the Uterus of Ovariectom ized Rats

CHEN Yong-jie1,BO Shu-m in2,SHEN Hong1
(1.Department of Animal Science and Technology;Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China; 2.Capital Institute of Physical Education,Beijing 100080,China)

ObjectiveTo study the effects of 17β-estradiol on the protein expression of β-catenin and E-cadherin in the uterus of ovariectomized rats.M ethods Three-month-old female Sprague-Dawley rats were random ly divided into three groups:sham-operation group,ovariectom ized group and estradiol group.17β-estradiol was injected subcutaneously three times a week at a concentration of 50 μg/kg for 10 weeks.The serum estradiol levels were determ ined by RIA,and the immunolocalization and content of β-catenin and E-cadherin proteins were detected by immunohistochemistry and Western blotting,respectively.ResultsThe uterus weight index and serum E2level were decreased in ovariectomized rats,and the decrease could be reversed by injection of estradiol.As a result,there was no significant difference between the sham-operation group and estradiol group.In the sham and ovariectomized groups,the positive immunoreactivity of βcatenin and E-cadherin proteins were present only in endometrial cell membrane.However,the positive immunoreactivity of E-cadherin protein was not only present in the cell membrane,but also was in cell nuclei in the estradiol group.The results of Western blotting further indicated that the content of β-catenin and E-cadherin proteins were significantly decreased in ovariectomized group compared with the sham-operation group and estradiol group.ConlusionThese results indicate that 17β-estradiol not only regulates the immunolocalization of E-cadherin protein in the uterus in ovariectomized rats,but alsostimulates the expression of β-catenin and E-cadherin proteins.

Estradiol;Ovariectomized rats;β-catenin;E-cadherin

R271.116

A

1005-4847(2010)02-0122-05

2009-08-19

国家自然科学基金资助(编号:30771046);北京市教委资助项目(KM200770029001,KM200910020006)。

陈永杰(1983-),男,硕士研究生,研究方向:兽医药理学E-mail:chenyongjie83@163.com

沈红,副教授,E-mail:shenhong912@sina.com

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