谷廷敏,谷 阳,隋志甫,刘静杰,赵志力*

(1.中国人民解放军北京军区总医院全军皮肤病诊治中心整形美容中心,北京 100125;2.中国西南财经大学统计学院,成都 610074)

烧伤创面内表皮生长因子、表皮生长因子受体、C-myc三种基因表达变化的临床观察

谷廷敏1,谷 阳2,隋志甫1,刘静杰1,赵志力1*

(1.中国人民解放军北京军区总医院全军皮肤病诊治中心整形美容中心,北京 100125;2.中国西南财经大学统计学院,成都 610074)

目的为探讨烧伤创面愈合机理,了解烧伤创面内表皮生长因子基因、表皮生长因子受体基因和C-myc基因的变化,为临床治疗提供依据。方法我们对25例病人烧伤创面的不同部位应用原位杂交方法,观察表皮生长因子基因、表皮生长因子受体基因和C-myc基因在烧伤创面肉芽中心部(肉芽中心部)、肉芽与愈合皮肤的交界部(创面交界部)、愈合皮肤部位(创面愈合部)和自身正常皮肤对照部位内表达强度和分布的特点。结果同一部位烧伤创面内,表皮生长因子基因和C-myc基因在交界部表达最强;烧伤创面中心部位表达次之,烧伤创面愈合部位表达较弱;表皮生长因子受体基因表达在创面中心部位表达较强,在表达交界部次之;在创面愈合部表达较弱;正常皮肤对照部位三种基因表达不明显。结论烧伤创面内表皮生长因子基因、表皮生长因子受体基因和C-myc基因在烧伤创面内有明显的规律性表达,表达与创面愈合密切相关。

烧伤创面;表皮生长因子基因;表皮生长因子受体基因;C-myc原癌基因;原位组织杂交

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1431)

创面愈合过程中多种生长因子和其相关基因表达对愈合产生很大的作用,研究这些变化对了解创面修复机理和促进临床治疗均有意义。既往我们报道过动物创面愈合过程中表皮生长因子(EGF)基因、表皮生长因子受体(EGFr)基因和临床供皮区创面愈合中C-myc原癌基因的表达变化,提示了创面愈合中上述三种基因的表达变化可能与创面修复过程明显相关[1-3]。为了解其变化的普遍意义,我们又观察了临床烧伤创面中上述三种基因的表达变化,探讨其意义,报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组病人25例,男18例,女7例。平均年龄35.3岁。平均烧伤面积23.4±6.2%TBSA。

1.2 标本留取 征求病人同意后,创面植皮手术时分别切取烧伤创面不同部位标本:包括创面肉芽中心部(简称创面中心部)、肉芽与愈合皮肤的交界部(简称创面交界部)、愈合皮肤部位(简称创面愈合部)和远离创面的自身正常皮肤作为对照部位;标本切取是用眼科角膜环钻切取包括创面、创基及少量皮下脂肪在内的标本1 cm3,置于4%的多聚甲醛液固定待用。

1.3 原位组织杂交方法 将留取的标本置于4%的多聚甲醛液固定,酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切成5 μ m的组织切片,用地高辛标记C-myc原癌基因和EGF、EGFr的cDNA探针后进行组织切片的原位杂交:组织切片脱蜡入水,0.2 mol/L盐酸酸化,蛋白酶K消化,酒精脱水,置预杂交液(42℃)预杂交4 h,入杂交液杂交(42℃)17 h后用 Boegringer Mannheim公司产品Dig-DNA labelling and detection试剂盒观察切片中C-myc、EGF和 EGFr活化表达的mRNA的变化情况,以确定创面愈合中C-myc原癌基因、EGF基因、EGFr基因表达状况。400倍光镜下测定其相对含量,以所见视野内无阳性细胞为阴性,连续记数5个视野,求出每个视野内阳性细胞数,当视野内有10个以下阳性细胞时,表达强度确定为弱阳性(+);当视野内有11-20个阳性细胞时,表达强度确定为中等阳性(++);当视野内有21个以上阳性细胞时,表达强度确定为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法 应用SPSS11.0统计软件处理组间变化,进行方差分析;P值＜0.05,表示差异有统计学意义。

2 结果

光镜下组织学所显示的地高辛标记C-myc、EGF和EGFr的cDNA探针所进行的原位杂交阳性细胞结果为分布于细胞浆或少量的胞核内的蓝紫色细颗粒。正常皮肤内无明显的阳性细胞。同一烧伤创面部位EGF基因和C-myc基因表达较为一致,主要在创面交界部位表达最强,创面的中层和深层均可见到阳性细胞,阳性细胞主要表达在成纤维细胞胞浆和创缘上皮基底细胞胞浆,少量还有在血管内皮细胞和皮肤附属上皮细胞中,密集分布,表达强度(++-+++),每个视野内EGF基因和C-myc基因阳性细胞数分别为23.60±3.23和25.50±4.6;创面中心部位表达次之,每个视野内EGF基因和C-myc基因阳性细胞数分别为12.30±1.23和14.61±2.6,表达强度在(+-++);创面愈合部位表达较弱,每个视野内EGF基因和C-myc基因阳性细胞数分别为5.40±1.23和7.52±1.70,表达强度在(+)左右。EGF基因和C-myc基因在以上各部位表达差别:P均＜0.05,有统计学意义。

EGFr基因表达部位与前两者不同,主要在创面中心部位表达较强,表达强度在(++-+++),每个视野内阳性细胞数为28.52±5.6,表达细胞也主要分布在创面内的成纤维细胞、创缘上皮基底细胞胞浆,还有血管内皮细胞和皮肤附属上皮细胞中,多较密集分布,创面的中层和深层多见到阳性细胞;在创面交界部位EGFr基因表达较创面中心部位表达次之,表达强度在(+-++),每个视野内阳性细胞数分别为16.32±2.0,而在创面愈合部位表达更弱,表达强度(+),每个视野内阳性细胞数分别为9.12±0.60,主要分布在创面浅层的成纤维细胞、上皮基底细胞胞浆内。EGFr基因在以上各部位每视野内阳性细胞数量差异,P值均＜0.05,有统计学意义。EGF、C-myc、EGFr三种基因在创面内表达变化见表1。

表1 EGF、C-myc、EGFr三种基因在创面内表达变化

3 讨论

创伤修复是机体对外来损伤刺激而引起的一系列信号反应,其最终目的是达到对损伤的修复,其中包括组织细胞的迁移增殖、肉芽组织的形成、细胞外基质沉积、再上皮化过程。创伤修复可以至少分为三个连续或者重叠的时期:炎症反应期、增值修复期和组织重塑期,各期均有创伤部位释放的多种生长因子调控促进修复;这些细胞因子如果调控失常会干扰正常的组织修复过程而出现愈合过慢形成溃疡或者愈合过度形成瘢痕[4]。组织损伤后局部发生许多重叠的生物、化学和细胞学反应、首先是局部血小板凝聚形成血块,炎性细胞如:中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等的侵入进行清创,巨噬细胞和成纤维细胞释放多种生长因子进行修复。巨噬细胞是创伤修复早期局部生长因子的主要来源,这些生长因子及其相关基因对组织的修复、调控发挥了很大作用[5],EGF、EGFr基因在调控组织细胞的增殖方面有很重要的作用,各种刺激引起EGF、EGFr基因表达后,组织中相应的细胞因子增多,从而促进细胞分裂增殖和创伤的愈合[6、7]。

C-myc原癌基因在调控组织细胞的增殖方面有很重要的作用,各种刺激引起C-myc原癌基因表达后,可以促进细胞由静止期(G0期)而进入分裂期(S期),促进细胞的分裂增殖。C-myc原癌基因表达的蛋白定位于细胞核,与产物定位于胞膜的一类癌基因(如ras基因)协调转化细胞,最终使细胞进入S期,C-myc基因参与了此过程并起重要作用,尤其是细胞从Go期进入G1期的过程,因此,C-myc原癌基因表达被人们看作是细胞有丝分裂的中介物[8、9]。

本研究表明:同一部位烧伤创面内表皮生长因子基因和C-myc基因在创面交界部位表达最强,烧伤创面中心部位表达次之,烧伤创面愈合部位表达较弱;而EGFr基因表达在创面中心部位表达较强,在创面交界部位次之,在创面愈合部位表达较弱。从组织学可以看到:创面愈合过程中创面交界部位是创面的再上皮化前沿部位,此部位创缘和创基增殖很明显,而在创面中心部位创缘和创基的增殖虽不明显,而此时 EGFr基因表达可能有助于细胞EGFr蛋白的合成,细胞高含量的敏感EGFr又有助于细胞结合EGF蛋白,发挥EGF生物效应。从组织学时相上看,创面中心肉芽部位、创面愈合交界部位和创面愈合部位应该是创面愈合的连续过程,EGFr基因在创面中心部位表达最强,而EGF基因和C-myc基因在创面交界部位表达最强有积极的生物学意义,EGFr基因早于EGF基因和C-myc基因的高表达更体现了组织细胞在为明显的宏观修复做好生理和生化方面的准备,创缘处细胞增殖组织修复旺盛,EGF、C-myc基因高强度表达,表明了这些生物因子对促进创缘处细胞增殖组织修复旺盛的作用;而创面愈合部位,虽然细胞增殖仍在旺盛进行,而EGF、EGFr、C-myc基因表达均明显减弱,这些基因表达变化可能与避免组织的过度修复相一致,也有积极意义。从表达的细胞可看出 EGF、EGFr、C-myc原癌基因多表达在创缘和创基的成纤维细胞、血管内皮细胞、皮肤附属上皮细胞,这些部位和细胞的 EGF、EGFr、C-myc原癌基因生物因子的高表达也提示了对组织修复的积极意义。

Leeni等报道:组织损伤后包括多种生长因子:如EGF、TGF-a、TGF-b,KGF 等通过激活 EGFr引起细胞迁移加快、细胞分裂增速,促进了组织愈合修复,而应用了EGFr抑制物就拮抗了这些生长因子的促修复作用[10]。从而证实了EGFr基因在创伤修复对介导多种生长因子的作用起很重要的调节作用。我们的实验证明:烧伤创面内EGF基因、EGFr基因、C-myc原癌基因有明显的规律性表达,提示了对介导多种因子促进细胞分裂增殖和创面愈合有重要作用。深入细致的研究,保持内源性分泌的生长因子和相关基因的表达以及结合外用方法达到促进创面修复的最佳状态,将会对促进组织修复产生很大的意义。

[1]谷廷敏,牛星焘,陈东明.创面愈合过程中EGFr基因表达的研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志,1996,2:206.

[2]谷廷敏,牛星焘,陈东明.创面愈合过程中 EGF基因表达的研究[J].中国修复重建外科杂志,1996,3:13.

[3]谷廷敏,李 文,隋志甫,等.临床修复中c-myc原癌基因表达变化的观察[J].中国康复杂志,2004,8(2):266.

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The observation of EGF gene,EGFr gene and C-myconcongene expression in the burns wound

GU Ting-min,GUYang,SUI Zhi-fu,et al.(The General Hospital of Beijing Command of PLA,Beijing100125,China)

ObjectiveTo detect the changes of EGF gene,EGFr gene and C-myc oncongene expressionsin the wound healing of the burn patients.MethodsEGF gene,EGFr gene andC-myc oncongene expression in the granulation center part of the burnwound(center part),the edge part between the granulation part and healed part of the burn wound(edge part),the healed part of the burn wound(healed part)and normal skin as control are detected by In situ Hybridization method.ResultsThere are remarkely regular expression of EGF gene,EGFr gene andC-myc oncongene in the burn wound,the most obviously expression of EGF gene and C-myc oncongene is in the edge part of the burn wound,more expression of EGF gene and C-myc oncongene is in the center part of the burn wound and some expression of EGF gene and C-myc oncongene is in the healed part of the burnwound.the most obviously expression of EGFr gene expression is in the center part of the burn wound,more expression of EGFr gene expression is in the edge part of the burn wound and some expression of EGFr gene expression is in the healed part of the burnwound,there is no obviously expression of EGF gene,EGFr gene and C-myc oncongene in the normal contral skin.Conclusionthe expression of EGF gene,EGFr gene andC-myc oncongene expression in the burns wound are closely relately to the wound healing,Their expression has important roles in the burns wound healing.

EGF gene;EGFr gene;C-myc concongene;Burn Wound;In situ hybridization

R644

A

1007-4287(2010)09-1431-03

国家自然科学基金资助课题(30973123)

*通讯作者

谷延敏,男,50岁,博士,副主任医师,北京军区总医院全军皮肤病诊治中心整形美容中心主任。主要研究方向:创伤修复与组织移植。

2009-11-27)