赖颖晖,赖永榕,杨高晖

(广西医科大学第一附属医院血液科,广西南宁 530021)

介导人α-反义寡核苷酸慢病毒载体的构建

赖颖晖,赖永榕*,杨高晖

(广西医科大学第一附属医院血液科,广西南宁 530021)

目的构建介导人α-反义寡核苷酸的慢病毒载体,为α-反义寡核苷酸对β-地中海贫血基因治疗的体内试验提供稳定的转染细胞载体。方法根据人α-反义寡核苷酸序列设计siRNA、合成DNA片段,通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGCSIL-vshR NA-GFP载体质粒,接着该质粒转化感受态的大肠杆菌E.coliDH5α,通过PCR及基因测序鉴定阳性克隆,再经Lipofectamine 2000将pGCSIL-vshRNA-GFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒系统共转染293 T细胞包装病毒,通过绿色荧光蛋白的表达测定收集的病毒滴度。结果重组质粒的外源基因PCR鉴定正确,基因测序结果与所需要的α-反义寡核苷酸序列完全一致,浓缩后病毒滴度为5×109TU/ml。结论成功构建介导人α-反义寡核苷酸的慢病毒载体。

慢病毒载体;反义寡核苷酸;基因治疗

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1358)

β-地中海贫血是一种对人类健康危害严重的遗 传性溶血性疾病。对重型β-地中海贫血,临床上缺乏有效的治疗手段,病人依赖于长期输血及去铁治疗来维持生命,费用巨大,死亡率极高[1]。造血干细胞移植是唯一的根治方法,但是由于合适供体来源

受限及费用昂贵,临床上难以广泛开展。基因治疗成为了β-地中海贫血治疗的希望。刘容容等[2]的研究所筛选出的反义寡核苷酸(ASON)能高效抑制人α-珠蛋白基因表达,并能有效地抑制体外培养的重型β-地中海贫血红系细胞α-珠蛋白基因表达,从而改善α/β+γ珠蛋白基因的比例失衡。……