严丽英 刘 佳 赵海亮

深圳龙岗中心医院(518116)

研究证实，分泌性中耳炎与咽鼓管功能不全、变态反应、感染等因素有关，但目前对其病因及发病机制尚未完全清楚。它的病发症状与中耳黏膜腺体和杯状细胞的增生有必然联系，这种黏膜高分泌所引起的中耳腔导致不易清除的黏液是其主要特征[1]。本实验主要致力于大鼠分泌性中耳炎模型中耳黏膜中黏蛋白的分泌；揭示MUC在分泌性中耳炎积液的发生、发展过程中所起的作用，以便深入认识分泌性中耳炎发病机制，为临床早期诊治提供理论和实验依据，并为分泌性中耳炎的预防和儿童听力保护做出有益探索，为其临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物

选择健康SD大鼠20只，雌雄不拘，体质量200～250mg，检查未见鼓膜异常及积液征。随机分为两组。菌株选取:实验组选择分泌性中耳炎最常见的病原菌——流感嗜血杆菌经鼓膜注入细菌悬浮液0.1mL；对照组注入等量生理盐水。

1.2 取材

术后1、3、7、14、18d，用1%苯巴比妥钠将动物全麻，在手术时用显微镜观察鼓膜的形态、颜色和色泽，然后断头迅速取下双侧听泡。解剖显微镜下观察鼓室内的黏膜及其积液情况。

1.3 方法

RNA的提取及RT-PCR实验:总RNA提取各组每只大鼠左侧听泡予焦碳酸二乙酯(DEPC)水冲洗2次。采用异硫氰酸胍裂解法提取左侧听泡鼓室黏膜组织总RNA[2,3]，分光光度计测量260和280nm的光密度比值，判断RNA纯度和浓度。

引物设计及合成由上海博亚生物工程公司合成，RT PCR引物根据GenBank中MUC5AC基因(基因号:U44946)、MUC2基因(基因号:U07615)、GAPDH(基因号:X02231)用DNAMAN 4.0程序设计如下:

MUC5AC基因引物序列:上游:5ˊCATAGCCTCCTCTTGTTC；下游:5ˊATTCCTGTAGCAGTAGTGAG。 MUC2基因引物序列:上游:5ˊAGATCCCGAAACCATGTC；下游:5ˊGTTCCACATGAGGGAGAGG。GAPDH基因引物序列:上游:5ˊGCTGGTGCTGAGTATGTCGT；下游:5ˊ GAATGGGAGTTGCTGTTGAA。

RT-PCR按Invitrogen公司一步法RT-PCR试剂盒说明书。在DNA 扩增仪上进行RT-PCR:50 ℃ 30min合成cDNA，94 ℃ 2min预变性并活化Platinum Taq之后，按94 ℃ 30s→55 ℃ 30s→72 ℃ 45s，进行36个循环的扩增，最后72 ℃延伸7min。RT-PCR产物用1.0% Agrose电泳分离鉴定。

半定量分析电泳的结果经过Gene Snap成像后再选用Gene Tools进行半定量分析。以曲线下峰面积作为PCR产物含量，用目的基因与同一标本内参照基因(GAPDH)积分值作对比，比较结果可显示该基因mRNA相对表达水平。

1.4 统计学处理

2 结 果

鼓膜情况:正常大鼠的鼓膜透亮，鼓室无积液，锤骨柄和光锥清晰可辨。造模后大鼠的鼓膜混浊，鼓室积液像，光锥消失。

术后1d，AP-PAS染色正常组和对照组中耳黏膜鼓岬处为立方或扁平上皮和薄层结缔组织(固有层)组成，黏膜下层有少数纤维母细胞和少许胶原纤维以及中性多形核白细胞、淋巴细胞，光镜下所有模型组咽鼓管上皮层次增多，黏液腺体扩张、数目增多，小血管明显充血并有中性粒细胞浸润和大量增多的分泌细胞。术后1周模型组鼓室黏膜上皮细胞和杯状细胞明显增生，炎性细胞浸润明显，电镜下可见大量的杯状(分泌) 细胞集结，表面有微绒毛，细胞内有大量成熟的亮颗粒和少许暗颗粒，部分排放到黏膜表面，呈游离的团状。上皮细胞的内质网扩张，线粒体变形，核固缩或整个细胞结构不清。黏膜下毛细血管扩张充血，明显增生。术后2周组和4周组出现成纤维细胞增生，有许多纤维母细胞和胶原纤维，新生血管增多，单核巨噬细胞浸润，中耳黏膜明显增厚。在细胞间和黏膜下层有许多黏液细胞和黏液滴。

总RNA中提取的RT-PCR结果将生物紫外分光光度仪(德国Eppendorf公司)下测其光密度(D)值，各样品的D(260 nm)/D(280 nm)均＞1.7，这可以充分表明提取的RNA纯度符合要求，1%琼脂糖凝胶电泳可见明显的18S和28S两条带，表明RNA具有良好的完整性。

预期的目的基因MUC2、MUC5AC片段长度分别为 356和391bp，MUC2在对照组中的耳黏膜呈弱势表达，实验组表达的明显性越强，差别就越具有统计学意义。对照组中耳黏膜MUC5AC不表达，实验组表达明显增强，两组比较差别有统计学意义(P＜0105)。

3 讨 论

近几年来耳鼻喉科的常见病症之一是分泌性中耳炎，它是小儿听力障碍的主要原因，严重影响着小儿语言的发育和智力的发展。特别提到的是慢性分泌性中耳炎，其病程长，迁延不愈。如不及时治疗则易导致鼓膜萎缩、鼓室硬化、慢性中耳炎、胆脂瘤、胆固醇肉芽肿等。其发病与中耳黏膜腺体和杯状细胞的增生有关，这种黏膜高分泌引起的中耳内出现不易清除的黏液是其主要特征[1]。黏蛋白是黏液的主要构成成分，是一种高度糖基化的大分子蛋白质，目前研究认为其高表达与中耳炎的发病关系密切。

到目前为至，人体中至少已有9种不同的黏蛋白被确认，且按其发现顺序命名为MUC1～4、MUC5Ac、MUC5B、MUC6～8[4-9]。MUC1、MUC3和MUC4属于膜结合性黏蛋白；MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6属于分泌性黏蛋白；MUC8仍不能确定。现已证明MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6黏蛋白的基因定位于染色体11p15.5，人们认为它们来源于同一原始基因，因此它们具有结构和基因组织的相似性。MCUI定位于染色体1q21～ 24，Muc3定位于染色体7q22，MUC4定位于3q29，MUC7定位于4q13～21，MUC8定位于12q24.3[10]。由于黏蛋白基因的激活和灭活同时具备器官特异性和上皮细胞特异性，所以某种特定的上皮细胞其黏蛋白基因所表达的表达模式不同。

从总体看，黏液基因蛋白可被分成两组:一为分泌性黏液基因蛋白(muc2、muc5B、muc5AC、muc6)，它以胶体形式存在于黏膜表面、胶体形式黏液基因蛋白的主要基因编码作为一簇位于11p15染色体上。另一种为膜结合蛋白，存在于上皮细胞的表层，原来认为只有MUC1一种以跨膜形式存在，但现在发现MUC3、MUC4也都以跨膜形式存在。黏蛋白是由杯状细胞分泌的，分布在上皮的表面，与细胞黏附，细胞保护、管腔表面润滑、入侵微生物的捕获以及肿瘤生物学等有关。黏蛋白多肽骨架的氨基酸序列有以下特点:高度串联重复氨基酸序列组成的结构域(domain) 占极高比例；重复单位富含具羟基侧链的丝氨酸和苏氨酸；重复单位的两侧(N和C端) 富含半胱氨酸。成熟的黏蛋白羟基侧链糖基化后形成O连接寡糖的糖蛋白；黏蛋白亚单位之间还可以通过半胱氨酸残基的巯基(HS-) 侧链相互作用形成二硫键，构成黏蛋白聚合体，使得黏液具有胶状特点[11]。其中MUC1、MUC4 和MUC5AC 的表达始终局限于表面上皮细胞，前二者(为膜结合型黏蛋白) 表达于杯状和纤毛细胞，MUC5AC 只在杯状细胞表达。

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