杜瑞平 高 民 卢德勋

共轭亚油酸（CLA）即共轭十八碳二烯酸，是必需脂肪酸亚油酸（LA）衍生的共轭双烯的多种位置与空间异构体的总称。CLA在不同的动物模型中均表现出提高免疫力效应、抗癌效应、降血脂和胆固醇效应；此外，CLA作为营养再分配剂能降低体脂、提高瘦肉率、改善肉品质[1]。目前CLA的生物调控作用已成为医学和营养学研究的热点之一。肌内脂肪与猪肉的肉质关系密切[2]，因此在猪肉品质调控中，如何在保持较少皮下脂肪沉积的同时提高肌内脂肪的含量成为目前猪肉质调控的一个关键点。诸多国内外的研究报道已表明，日粮中添加CLA能够显著抑制猪皮下脂肪沉积，提高瘦肉率[3－5]，同时能提高肌内脂肪含量，改善猪肉品质[6－8]。这些结论表明，CLA对猪皮下脂肪和肌内脂肪沉积的调控存在差异，但具体机制尚不清楚。

CLA混合异构体中只有c9，t11和t10，c12是最主要的生物活性异构体。c9,t11－CLA在提高动物机体的免疫力、抗癌和提高动物的生长性能等方面作用较大[9－10],而t10,c12－CLA在改变动物机体的脂肪代谢方式以及降低脂肪在动物体内的沉积方面起主要作用[1,11]。尽管t10,c12－CLA降低体脂沉积的效果已得到大多数试验研究的证实，但其作用机理尚未研究清楚。动物脂肪的沉积主要取决于脂肪细胞的数量与体积,即脂肪前体细胞的增殖与分化能力，脂肪前体细胞的增殖与分化受机体内各种因子和营养因素的调控[12]。目前关于CLA对前体脂肪细胞增殖和分化的试验结论还存在差异[13－15]。鉴于 c9，t11－CLA 和 t10，c12－CLA在调控动物机体代谢方面的不同，本研究在建立30日龄猪皮下脂肪和背最长肌组织块体外培养体系以及两个部位前脂肪细胞培养体系的基础上，采用MTT法、油红O染色及荧光定量PCR技术从细胞形态学角度和脂肪前体细胞分化调控角度探讨t10，c12－CLA猪皮下和背最长肌脂肪前体细胞增殖与分化的影响，为揭示CLA对猪皮下和肌内脂肪沉积的差异调控机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

内蒙古农牧业科学院猪场30日龄猪。

1.2 试验试剂

t10，c12－CLA 购买自 Matreya公司；胰岛素、地塞米松、甲基异丁基黄嘌呤、青霉素和链霉素购买自Sigma公司；DMEM/F12干粉培养基、胎牛血清、牛血清白蛋白和胶原酶Ⅱ购买于Gibico公司；RNA提取、反转录和普通PCR反应所用试剂及定量PCR试剂盒（SYBR Green PCR Kit）购自上海生物工程技术有限公司；DNA Marker（DL1000）购自 TAKARA 公司，其余化学试剂购自南京建成生物试剂公司。

1.3 主要溶液配制

DMEM/F12培养液：10.0 g/l DMEM/F12培养基，三蒸水，10%胎牛血清，100 IU/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，1.2 g/l NaHCO3，过滤（0.22 μm 滤膜）除菌，分装，4℃备用。

组织消化液：Ⅱ型胶原酶配成1mg/ml HBSS液，过滤除菌，－20℃储存备用。

100 μmol/l CLA 液:先用 100 μl无水乙醇溶解25mg CLA，加入8.93 ml培养液配成0.01 mol/l的母液，滤菌，－20℃保存，使用时用培养液稀释即可。

分化储备液：分别称取胰岛素5.00mg、地塞米松0.2mg、甲基异丁基黄嘌呤55.63mg溶于500 μl无水乙醇中，待完全溶解后加三蒸水至50 ml，滤菌，－20℃保存。

MTT溶液：将5mg MTT溶于1 ml培养液，过滤除菌，4℃避光保存。

油红O染液：混合0.7 g油红O与200 ml纯异丙醇，室温过夜，滤纸滤过，用120 ml蒸馏水稀释180 ml染液，置4℃过夜后室温保存。

1.4 组织块培养[16]

（1）无菌切取仔猪肩胛部皮下脂肪约5 g、背最长肌约 8 g，75%酒精中浸泡 3～5 s，然后用 D－Hanks液清洗3次，置于消毒的Hanks液中；（2）在培养液或者平衡盐溶液中分离去除组织中可见的纤维及血管,反复剪切至1 mm3大小为止（呈糊状）。然后用吸管吸取Hanks液把附着在剪刀上的组织小块冲下，并补加3～5 ml Hanks液后，去上清，余下的组织块即可用于培养；(3)用眼科探针将组织小块均匀摆布于60 cm的培养皿，置 5%CO2、37℃培养箱1～2 h左右，再向底部轻轻注入5 ml完全培养液，于CO2培养箱 (37°C,5%CO2)中静置培养，开始2 d尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养第3 d换液，此后每2 d换液一次。细胞汇合后用基础培养液漂洗（一定不要剩余血清）,然后改用无血清分化培养液培养至第10 d。

1.5 MTT法检测细胞增殖[16]

（1）前脂肪细胞的分离和培养：将组织块在培养液或者平衡盐溶液中剪碎后，静置，吸去上清液，把组织转入消化瓶中，加组织消化液，置37℃振荡摇床内(40 r/min)孵育60～80 min后取出；把消化成糊状的组织转入50 ml离心管中，1 000 r/min，室温离心5～10 min；弃上清，加入含血清的培养液以终止蛋白酶活性，无血清培养液洗2遍，在沉积上留少量液体(0.5 ml)；用吸管反复吹打，使成悬液，通过70目和300目细胞筛滤过入干净的消毒离心管中，1 000 r/min室温离心10 min，吸出上清液，用适量基础培养液漂洗；把细胞沉积重悬于5～10 ml完全培养液吹打均匀，计数并调整浓度，以5×104个细胞/cm2接种于96孔培养板，每孔加180 μl完全培养液。接种后1 d换液，此后每隔 2 d 换液一次。分别在试验 1、2、3、5、7、9 d 取一块培养板终止培养。

（2）测定时每孔加入20μlMTT液，继续培养3～4h。

（3）吸去100 μl培养液，加入等量DMSO使结晶物充分溶解，在微型振荡器振荡5 min。

（4）在酶标仪上测定光吸收。测定波长为490 nm，参考波长为630～690 nm。

以时间为横轴，光吸收值为纵轴，绘制曲线。同时与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔，其它试验步骤保持一致，最后比色时，以空白孔调零。

1.6 油红O染色[17]

①培养第8 d，吸出培养液，PBS液漂洗2次，加1 ml 10%的甲醛固定，室温过夜；②去除甲醛用60%的异丙醇洗30 min；③用油红O染色1 h，去除染液，用60%的异丙醇洗5 s并不断摇动，用水彻底冲洗后干燥；④显微镜下观察，在510 nm处比色，记录吸光度值。

1.7 荧光定量PCR

1.7.1 引物设计与合成（见表1）

登陆NCBI网站查询相关基因序列，使用DNAMAN软件设计PCR特异引物，委托上海生物工程公司合成。将冻干粉状态的引物离心后，用灭菌超纯水配制成 100 μmol/l贮备液和 20 μmol/l工作液，－20 ℃保存。

1.7.2 荧光定量PCR

定量PCR反应体系见表2。优化反应程序如下：①95℃预变性 15 min；②95℃变性 30 s；③53～60℃退火30s；④72℃延伸30s，循环40次；⑤72℃延伸1 min；⑥70～95℃生成融解曲线。反应结束后，样品保存于－20℃环境中备用。

1.8 试验设计

表1 引物设计参数

表2 荧光定量PCR反应体系

共设2个处理，处理1为阴性对照（添加0.1 mmol/l BSA），处理 2 添加 100 μmol/l的 t10，c12－CLA，每个处理设6个平行，培养开始即加入BSA与t10，c12－CLA进行处理至第10 d。试验结束后收集细胞提取RNA在－70℃保存备用。

1.9 数据处理

采用SPSS 11.5软件中单因素方差分析进行统计。P＜0.05时确定为差异显著，P＜0.01时确定为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 t10,c12－CLA对猪皮下与背最长肌脂肪前体细胞增殖的影响（见图1、图2）

图1 MTT测定t10,c12－CLA对皮下与肌内前脂肪细胞增殖的影响

MTT法是检测细胞相对活力和增殖情况的经典方法，图1和图2为猪皮下脂肪和背最长肌两个部位的 t10,c12－CLA 处理组与对照组在第 1、2、3、5、7 和 9 d时的MTT测定结果。结果表明，两个部位不管是t10,c12－CLA处理组还是对照组，细胞生长第2 d均进入增殖潜伏期，第3～7 d生长旺盛，进入指数期，8 d后长势渐缓，进入平台期。各组前脂肪细胞的生长曲线近似“S”形。

图2 MTT测定t10,c12－CLA对皮下与肌内前脂肪细胞增殖的影响

结果进一步显示，100 μmol/l t10,c12－CLA对猪皮下前脂肪细胞的增殖影响在第1、2 d差异不显著，第3 d后均显著抑制其增殖（P＜0.05）；而该剂量对猪肌内前脂肪细胞的增殖影响测定全期均不显著（P＞0.05）。已有的文献表明，t10，c12－CLA 能显著抑制人前脂肪细胞和 3T3－L1前脂肪细胞的增殖[18－19]。Meadus等（2002）的研究表明，各CLA异构体对猪的前脂肪细胞增殖没有影响[20]，而 Brandebourg 和 Hu（2005）则报道，t10，c12－CLA显著抑制了体外培养的猪前脂肪细胞的增殖[13]。本研究结果则表明100 μmol/l t10,c12－CLA处理对猪皮下脂肪和背最长肌两个部位前体脂肪细胞的增殖影响存在差异且伴随时间效应。

2.2 t10,c12－CLA对猪皮下与背最长肌脂肪前体细胞分化的影响（见图3）

图3为试验第8 d分化后期猪皮下和背最长肌两个部位脂肪前体细胞油红O染色提取分析结果。结果表明，两个部位脂肪细胞均脂滴积聚明显，皮下部位的t10,c12－CLA处理组油红O染色OD值显著下降（P＜0.05），相反背最长肌部位的 t10,c12－CLA 处理组油红O染色OD值显著上升（P＜0.05），这充分说明100 μmol/l t10,c12－CLA显著抑制了猪皮下前脂肪细胞分化而促进了背最长肌前脂肪细胞分化。结合MTT检测与油红O染色的结果表明，100 μmol/l t10,c12－CLA（10 d处理）显著抑制了猪皮下前脂肪细胞增殖与分化，促进了背最长肌前脂肪细胞的分化（P＜0.05），但对背最长肌前脂肪细胞的增殖影响并不显著，该结论与部分学者报道一致。也从细胞形态学角度充分说明t10,c12－CLA对猪皮下和背最长肌脂肪前体细胞增殖与分化存在差异调控作用，具体的调控机制还需进一步明确。

图3 油红O测定t10,c12－CLA对皮下与肌内前脂肪细胞分化的影响

2.3 t10,c12－CLA对猪皮下与背最长肌脂肪前体细胞分化关键转录因子的影响（见图4）

图4 转录因子PPARγ、ADD1和C/EBPα的相对基因表达水平

图4为荧光定量PCR测定三大分化转录因子PPARγ、C/EBPα及ADD1的相对定量结果,结果表明，100 μmol/l t10,c12－CLA显著抑制了猪皮下脂肪PPARγ的基因表达，促进了猪背最长肌的PPARγ与ADD1 的基因表达（P＜0.05），而对皮下脂肪 C/EBPα、ADD1及背最长肌的C/EBPα基因表达均无显著影响（P＞0.05）。PPARγ、C/EBPα 及 ADD1是调控前脂肪细胞分化的关键转录因子，它们彼此协作促进与脂肪终末分化有关的特异性基因表达，在脂肪细胞分化过程中起正向调节作用，被认为是脂肪形成的关键调节因子。PPARγ控制脂肪的储存和释放，维持机体能量平衡，调节胰岛素抵抗及血糖的稳定，促进脂肪细胞特异性基因表达[21]。而C/EBPα能结合和反式激活许多脂肪细胞特异性表达基因的转录,如AP2、SCD1、GLUT－4、PEPCK、Leptin和 INSR 等基因，在脂肪细胞分化后期发挥了重要作用[22]。ADD1是动物脂肪代谢中重要的核转录因子，它通过调节LDLR、ACC、FAS和PEPCK等有关脂肪合成和葡萄糖代谢的基因来调控动物体内的脂肪合成[23]。Tsuboyama等（2003）证明，在体内CLA能降低ADD1基因mRNA水平的表达，从而抑制PPARγ的表达和活性[24]。Brown等（2003）报道，在人类前脂肪细胞中，t10，c12－CLA可减少PPARγ的表达，使甘油三酯减少[25]。通过对小鼠、人和猪的脂肪组织及3T3－L1前脂肪细胞系的研究表明，添加 CLA（主要是 t10，c12－CLA）使 PPARγ 基因表达显著下降[14－15]。本试验结果也表明 t10，c12－CLA 显著影响了猪皮下脂肪与肌内脂肪的PPARγ的表达进而影响了两个部位前脂肪细胞的分化。

3 讨论

目前，关于CLA对前脂肪细胞增殖和分化的研究模型多集中在体外培养的人和啮齿类动物前脂肪细胞或细胞系（如 3T3－L1）上[11,14－15,18－19,25,29－30]，猪上的研究并不多见[13,20,27－28]，而且研究结论并不一致，试验条件（培养条件、细胞来源、CLA来源、处理时间等）的差异可能是造成这些报道结果不同的主要原因。关于CLA对前脂肪细胞分化的影响，人前脂肪细胞分化的体外研究表明，t10，c12－CLA能显著降低人前脂肪细胞的分化以及脂肪细胞中脂类物质的沉积[15]。t10，c12－CLA对3T3－L1前脂肪细胞的分化过程也有显著的抑制作用[14,19]。Ding等（2000）结果表明，CLA处理促进猪前脂肪细胞的分化[26]。Meadus等（2002）的研究结果表明，CLA处理对猪前脂肪细胞的分化没有影响[20]；而 Brandebourg 和 Hu（2005）则报道，t10，c12－CLA能显著抑制猪前脂肪细胞的分化和甘油三酯的沉积[13]。周玄（2007）研究了CLA混合体和单体对新生仔猪皮下脂肪和肌肉内血管基底细胞中脂类生成的影响，研究表明，t10，c12－CLA抑制了该部位脂肪前体细胞的增殖和分化；同时促进了肌肉内血管基底细胞分化，但对其增殖没有影响[27]。

本试验中，结合前面的研究结果，我们可以得出这样的推断，即t10,c12－CLA通过下调猪皮下脂肪内PPARγ的基因表达，进而可能抑制皮下前脂肪细胞分化，最终降低猪皮下脂肪沉积；相反t10,c12－CLA通过上调猪背最长肌的PPARγ与ADD1的基因表达，进而可能促进肌内前脂肪细胞分化并最终提高肌内脂肪沉积。

4 结论

本试验条件下，100 μmol/l t10,c12－CLA 显著抑制了猪皮下前脂肪细胞增殖与分化及PPARγ的基因表达，促进了猪背最长肌的前脂肪细胞分化及PPARγ与ADD1的基因表达，这些结果从脂肪细胞形态学和分化转录因子角度初步揭示了t10,c12－CLA对猪皮下和背最长肌脂肪沉积的差异性调控作用。

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