王柏琦 陈艳华

RECK基因是1998年发现的一种新的抑癌基因，它能在转录后水平抑制基质金属蛋白酶(MMP)的活性[1]，而后者能降解基底膜与细胞外基质(ECM)，从而导致肿瘤细胞转移。而在肿瘤细胞中，RECK基因几乎不表达或低表达，而且其启动子区域通常有异常的甲基化而失活。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从绿茶中提炼出的一种茶多酚。体外研究表明，它能抑制多种肿瘤细胞的生长[2]。本研究试图探讨EGCG对结肠癌细胞RECK甲基化有何影响，以及与细胞增殖、分化与死亡等多种生理活动的关键分子——p38信号通路的激活有何关系。

1 材料和方法

1.1 材料 人结肠癌HT-29细胞株购自中科院上海细胞库。抗P38磷酸化/非磷酸化单克隆抗体购自Cell signaling，EGCG为Sigma产品(纯度98%)，SB203580购自Meck。基因甲基化特异性PCR(MSP)扩增试剂盒购自Chemicon，Wizard DNA纯化试剂盒购自Promega，ECL化学发光试剂盒购自Pierce。

1.2 细胞实验、DNA提取及亚硫酸氢盐修饰 HT-29于含McCoy’s 5-A和含10%马血清的培养液(Gibco)中，37℃、5%CO2培养箱中培养。实验前调整密度为104/ml，随后与50μM EGCG孵育36h。完毕后用PBS洗涤，加入细胞裂解液及蛋白酶K37℃23h，随后加平衡酚及氯仿/异戊醇抽提，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积预冷的无水乙醇沉淀。用70%乙醇洗涤后收集沉淀DNA并测定DNA含量和纯度。亚硫酸氢盐修饰按照试剂盒提供的方法进行。

1.3 PCR 甲基化特异性RECK基因引物按照参考文献提供的方法设计[3]，序列由上海生工合成。反应条件：95℃10min预变性后，进入95℃30s，56℃30s，72℃30s的循环，共计40次，末次循环后72℃7min，终止反应。同时选用GAPDH作为内参。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4 Western blot 细胞孵育结束后，加入100～200μl裂解液的比例加入裂解液，充分裂解后，10000rpm离心5分钟，取10μg蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜，5%BSA4℃封闭过夜后与抗p38单克隆抗体孵育，经TBST洗膜、孵二抗后ECL显影。

2 结果

2.1 EGCG能降低HT-29细胞RECK基因启动子甲基化水平 如图1所示，HT-29细胞静息状态下可检测出明显的甲基化条带(图1A: lane 1)，当与50μM EGCG孵育36h后，其甲基化水平明显降低(图1A: lane 2)，而非甲基化基因有所增高(图1 B：lane 2)。内参GAPDH在各组中均保持恒定。p38特异性抑制剂SB203580也具有EGCG类似的效果(图1A、B：lane 3)。

2.2 EGCG能抑制p38磷酸化 HT-29细胞细胞未加入EGCG时，Western blot结果显示p38具有较高的磷酸化水平(图2A：lane 1)，当与50μM EGCG孵育36h后，其磷酸化水平明显降低(图2A：lane 2)。而总p38在实验前后保持恒定(图2B)。

3 讨论

在人类探索肿瘤的曲折道路中，肿瘤转移抑制基因，尤其是抑癌基因甲基化失活是近年来的一大研究热点。茶多酚是从绿茶中提取的一种多酚化合物，其中主要活性成分为EGCG，它对多种肿瘤，包括胃肠道肿瘤，前列腺癌，宫颈癌，白血病等具有化学预防作用。迄今为止，有关EGCG对结肠癌细胞生物学功能影响方面的研究相对较少。在本研究过程中，我们试图研究EGCG对结肠癌细胞RECK基因甲 基化是否 具有抑制效 应，并从 肿瘤发生的 重要信号通路p38激酶 出发，探 讨EGCG对p38磷酸化有何 影响，为治疗结肠癌 寻找一种新 的有效化 疗药物提供 理论基础 。

图1 EGCG对HT-29细胞RECK基因启动子甲基化水平的影响

图2 EGCG对HT-29细胞p38磷酸化的影响

本研究通过采用MSP法对RECK基因甲基化进行了研究，结果显示：EGCG处理后的结肠癌HT-29细胞RECK基因启动子区域的甲基化状态明显降低，而非甲基化的RECK基因有所增多，表明EGCG能逆转肿瘤组织中的RECK甲基化水平。癌变是正常细胞分化异常、增殖过度与凋亡受阻的结果，信号传导通路的异常在这些过程中起重要作用，其中，生长因子激活的受体酪氨酸激酶传导通路与细胞的增殖关系密切。P38是丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号传导通路之一[4]，经EGCG孵育后的结肠癌细胞p38磷酸化水平受到明显抑制，同时，经p38特异性抑制剂SB203580处理后的HT-29细胞，RECK甲基化情况与EGCG类似，说明在EGCG诱导HT-29细胞表达RECK的过程中，RECK基因的甲基化水平很可能受到p38的调节。EGCG—p38—RECK—MMP这一传导通路的关系，在EGCG的抗肿瘤过程中很可能具有重要作用。

[1]Takahashi C,Sheng Z,Horan TP,et al.Regulation of matrix metalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECK[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998 Oct 27,95(22):13221-13226.

[2]Ho YC,Yang SF,Peng CY,et al.Epigallocatechin-3-gallate inhibits the invasion of human oral cancer cells and decreases the productions of matrix metalloproteinases and urokinase-plasminogen activator[J].J Oral Pathol Med,2007 Nov,36(10):588-593.

[3]Fang MZ,Wang Y,Ai N,et al.Tea polyphenol(-)-epigallocatechin-3-gallate inhibits DNA methyltransferase and reactivates methylation-silenced genes in cancer cell lines[J].Cancer Res,2003 Nov 15,63(22):7563-7570.

[4]Feng Y,Wen J,Chang CC.p38 Mitogen-activated protein kinase and hematologic malignancies[J].Arch Pathol Lab Med,2009 Nov,133(11):1850-1856.