何丽丽,李春玲,王贵平,贾爱卿,杨冬霞,宣春玲,郑铁锁,王金生

(1.广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生公共实验室,广东 广州 510640;2.南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)

副猪嗜血杆菌病又称猪格氏病,主要引起猪的纤维素性多发性浆膜炎和关节炎,甚至脑炎,其病原为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)。此病过去一直被认为是仔猪的一种散发性、应激性疾病。但是近年来,随着养猪产业化的发展,越来越多的高健康猪群或SPF猪群的出现,这些猪如果处于一种未免疫状态,一旦Hps入侵,就会受到严重感染,甚至死亡。各种日龄的猪均可感染[1]。Turni C等[2]研究表明副猪嗜血杆菌病的发病率可达50%～70%,死亡率可达10%以上。近年来,美国、日本、加拿大、德国、澳大利亚、丹麦、西班牙等养猪业较发达的国家均已对本国的副猪嗜血杆菌病的流行情况进行了调查,结果显示副猪嗜血杆菌从临床发病猪中的分离率可达20%,而且流行的副猪嗜血杆菌血清型通常为毒力较强的血清型,如血清5型、4型和13型等[3],这些血清型在我国绝大多数猪场也存在和流行。目前,副猪嗜血杆菌已成为影响世界畜牧业经济发展的重要致病菌,受到越来越多的关注。在我国,近年来由副猪嗜血杆菌引起猪的浆膜炎和关节炎的报道越来越多,此病给养猪业带来了惨重的经济损失。为了解广东地区猪场中副猪嗜血杆菌的感染状况,课题组对广东省部分猪场送检病料进行了副猪嗜血杆菌分离和鉴定,将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 样品 2007年9月～2008年9月,从广东地区37个发病猪场送检病猪中采集病料372份,采集部位包括心、心血、肺 、肝、脾 、肾、脑、扁桃体 、淋巴结、心包积液、关节液。

1.2 主要试剂 10×Buffer、dNTPs、Taq酶购自TaKaRa公司;TSA、TSB培养基购自Oxioid公司;微量生化管、药敏纸片均购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离 无菌取病变组织,分别接种于TSA、TSB培养基上,37℃培养16～18 h。

1.4 涂片镜检 挑取平板上典型的单个菌落涂片,革兰染色后在油镜下观察细菌形态。

1.5 PCR扩增反应 根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,序列分别为:

上游 :5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′

下游 :5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′

预期扩增片段大小为822 bp。

1.6 生化鉴定 采用微量生化管法,取单菌落纯培养后分别接种于果糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、木糖、L-阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、吲哚、脲酶、蔗糖等微型生化鉴定管[4],接种前先在生化管里加入V因子,同时做触酶试验。

1.7 耐药性检测 根据2000年美国NCCLS所建议的药敏试验药物选择规则选取药敏纸片,用无菌镊子夹无菌棉花蘸取副猪嗜血杆菌TSB培养物,涂布接种于TSA平板上,待稍干后,用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴于培养基表面,37℃培养20～24 h后,测量抑菌圈直径,根据美国NCCLS细菌药物敏感试验判定标准判定结果。

1.8 统计处理 统计副猪嗜血杆菌分离率、猪场阳性感染率及不同时间、不同地区的分离率等。

2 结果

2.1 细菌的分离与鉴定 分离菌为革兰阴性,具多形性,从短杆状到细丝状;TSA固体培养基37℃培养16～24 h后,菌落透明、光滑湿润,具有蓝色荧光,见图1。PCR鉴定结果见图2。

图1 Hps在TSA平板上的菌落形态

2.2 副猪嗜血杆菌的分离结果 2007年9月～2008年9月,共检测病料372份,PCR扩增副猪嗜血杆菌阳性52份,但只有39份病料中分离到副猪嗜血杆菌,实际分离率(10.48%)要低于PCR检出率(13.98%);来源于广东地区37个猪场的125头发病猪中,从30头病猪都分离到副猪嗜血杆菌,分离率可达24.00%。

图2 Hps分离株16S rRNA PCR扩增结果

2.2.1 不同时间副猪嗜血杆菌的检出情况 副猪嗜血杆菌病在2007年12月～2008年2月发病率较高,而3～9月发病率相对较低,此病发生可能与气候有关,该病于秋、冬季发病率要高于春、夏季,见表1。

表1 不同时间副猪嗜血杆菌的检出情况

2.2.2 广东省不同地区副猪嗜血杆菌检出情况从37个发病猪场中,共检测出副猪嗜血杆菌阳性猪场15个,猪场平均阳性率达40.54%,说明副猪嗜血杆菌病在广东地区已普遍流行;而且以粤东地区最高,这可能与这些地区养猪业比较发达、猪场规模化和集约化程度高有关,见表2。

表2 广东省不同地区副猪嗜血杆菌检出情况

2.3 副猪嗜血杆菌分离株生化鉴定 多数副猪嗜血杆菌分离株只发酵果糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖,触酶阳性,不发酵棉籽糖和吲哚等,见表3。

2.4 副猪嗜血杆菌分离株药敏试验 23株副猪嗜血杆菌分离株对头孢氨噻肟、头孢曲松钠、阿奇霉素、氟苯尼考、强力霉素、左氟沙星等抗生素敏感;对阿莫西林、先锋霉素Ⅴ中度敏感;而对复方新诺明、磺胺异恶唑、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、氧氟沙星、丙氟哌酸、恩诺沙星等耐药,见表4。

3 讨论

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道(鼻腔、扁桃体和气管前段等)的常在菌,但是在不利的饲养环境下,它能够侵入宿主其他器官,引起猪的格氏病,属于一种条件性致病菌[5]。副猪嗜血杆菌病通常引起猪的浆液纤维素性甚至脓性纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑炎、败血症伴随卡他性支气管肺炎,临床症状包括高烧(41.5℃)、咳嗽、腹式呼吸、关节肿胀和一些中枢神经症状,如侧卧、震颤[6],影响猪的生长,也能导致猪的突然死亡。本研究所调查的副猪嗜血杆菌发病猪场,主要表现为猪的关节肿胀、咳嗽、全身发红,剖检观察,可以发现大多数病猪心包积液、胸腔积液、心脏表面包裹一层纤维素性渗出物、血凝不良、肺间质增宽;或者肺脏肉样变、肺与心包粘连、扁桃体充血、关节有浆液性或者脓性渗出物,部分病猪脑部充血、水肿积液。

表3 部分副猪嗜血杆菌分离株生化鉴定结果

表4 23株副猪嗜血杆菌分离株耐药情况

从2007年9月～2008年 9月,共检测 125头患病猪,从其中的30头病猪体内分离到副猪嗜血杆菌,分离率达24.00%;从372份病料中的39份病料分离到副猪嗜血杆菌(不包括扁桃体、鼻拭子),病料分离率达10.48%,猪场平均阳性率达40.54%,与国内外报道相似[7]。而且副猪嗜血杆菌阳性猪场都不同程度的伴有繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒的感染。

副猪嗜血杆菌是V因子依赖菌,对生长条件要求比较苛刻,分离比较困难,作者通过分离发现副猪嗜血杆菌从心脏、肺脏的分离率高于从心包积液、关节液的分离率,病料超过12 h或使用过比较多的抗生素治疗的病猪,副猪嗜血杆菌的分离率就会更低。副猪嗜血杆菌在培养过程中很容易污染,保存时间短,因此要注意进行副猪嗜血杆菌的纯化与鉴定。

副猪嗜血杆菌病在规模化的猪场暴发的频率越来越高,但到目前为止,副猪嗜血杆菌的毒力因子、副猪嗜血杆菌病的发病机理等尚不清楚。而HPS的血清型众多,血清型之间缺乏有效的交叉保护,副猪嗜血杆菌又具有明显的地方特征,因此,开展不同地区副猪嗜血杆菌的流行病学调查,了解其流行的主要血清型,以研制出适合当地使用的疫苗,对于有效的控制和预防该病至关重要[8-9]。

[1]Peter Kielstein,Vicki J Rapp-Gabrielson.Designation of 15 Serovars of Haemophilus parasuis on the Basis of Immunodiffusion Using Heat-Stable Antigen Extractst[J].American Society for Microbiology,1992,30(4):862-865.

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[4]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:125.

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