邱印利,刘 娟

(西南大学荣昌校区动物医学系,重庆 荣昌 402460)

中医认为,肾藏精,精生髓,髓养骨而通于脑。补肾壮阳中药补骨脂、淫羊藿具有补肾壮阳,益精健骨的功效,现代中药药理学研究结果表明,补骨脂、淫羊藿具有广泛的药理作用,对机体免疫系统、造血系统、心血管系统和生殖系统等都有很好的调理作用[1]。淫羊藿主要化学成分为黄酮类化合物,包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷、脱水淫羊藿素等[1]。补骨脂中含有多种活性成分,到目前为止,国内外研究人员已从补骨脂中分离出香豆素类、黄酮类、单萜酚类,以及豆甾醇、谷甾醇葡萄糖苷,十三烷等化合物40余种[2],其中,香豆素类及黄酮类化合物是其主要成分。补骨脂、淫羊藿黄酮类有抗氧化作用[3-4]。林举择等用MT T法测定补骨脂注射液对大鼠成骨细胞增殖的影响,显示补骨脂对新生大鼠成骨细胞的增殖有显著促进作用[5]。但还未见补骨脂、淫羊藿总黄酮对成骨细胞影响的报道,因此本次试验拟提取补骨脂、淫羊藿总黄酮,并测定对成骨细胞增殖的影响,以期为其补肾功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 RPMI-1640培养基(Initrogen Corporation USA),MT T(Sigma 14024),标准新生牛血清(郑州佰安生物工程有限公司),SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所,20080826),MDA测试盒(南京建成生物工程研究所,20080826),胰蛋白酶(美国ICN),TE2000-S倒置显微镜(Nikon),680型酶标仪(Bio-Rad laboratories Ltd.USA),SW-CJ-2F型超净工作台(苏州净化),3111型隔水式二氧化碳培养箱(Thermo Electron Corporation USA),补骨脂、淫羊藿总黄酮(由本校中药研发实验室提取鉴定)。

1.2 兔成骨细胞的原代培养与纯化[6]处死初生的兔仔,75%酒精浸泡5 min后,无菌条件下取其颅盖骨,刮去软组织,无菌Hank′s液(含青霉素 3×105IU/L、链霉素 3×105μg/L)冲洗后 ,剪成约1 mm3大小的碎块,0.25%胰蛋白酶,37℃下搅拌消化15 min,弃消化液,无血清培养液反复吹打清洗后,将组织块均匀铺在细胞培养瓶底,加少量含10%胎牛血清的1640完全培养液,倒置于37℃含5%CO2的培养箱,4 h后,小心添加足量1640完全培养液,继续培养,每3天换液1次。细胞长满瓶底时,0.25%胰蛋白酶消化,细胞悬液先接种到培养瓶内,5 min后轻吸出含未贴壁细胞的培养液,再接种于另一培养瓶中,重复这一操作3次,纯化成骨细胞。继续培养用第3代细胞进行以下试验。

1.3 MT T法测定补骨脂、淫羊藿总黄酮对正常兔成骨细胞增殖的影响 RPMI-1640培养基培养的成骨细胞消化传代后,调整细胞浓度为1×106/mL,然后加入96孔细胞培养板中,每孔加入180μL该培养液,放入37℃5%CO2培养箱内培养24 h后(显微镜下观察细胞生长情况),待细胞生长合适后,弃去96孔板中的细胞培养液,加入无血清的培养基180μL,然后分别加入药液(浓度为 1×10-6g/L、1×10-7g/L、1×10-8g/L)20μL,待其分别作用 6 h后,每孔加M TT溶液20μL继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL二甲基亚砜,振荡10 min,使结晶物充分融解。然后选择490 nm波长,在酶标仪测定各孔光吸收值。

1.4 MT T法补骨脂、淫羊藿总黄酮对氧化损伤成骨细胞增殖的影响[7]成骨细胞用含10%小牛血清的细胞培养液稀释成 1×105个/mL的细胞悬液,以200μL/孔加入96孔培养板,24 h后吸弃培养液;随机分成空白对照组、损伤模型组、试验组。空白对照组:加入无血清的培养基200μL培养24 h;损伤模型组:加入无血清的培养液培养24 h后,加入含终浓度为150 μ mol/mL的H2O2的细胞培养液作用 30 min;试验组:加入无血清的培养基180μL,然后分别加入浓度为1.0×10-6g/L药液20μL,培养 24 h 后,加 150 μ mol/mL 的 H2O2作用30 min;取培养液上清液待用。然后按照测定正常细胞增殖的MT T法对各组细胞的增殖情况进行测定。

1.5 补骨脂、淫羊藿总黄酮对成骨细胞培养液中SOD活力及MDA含量的影响 用1.4项培养液测定SOD活力和MDA含量。SOD活力测定:采用黄嘌呤氧化酶法,操作步骤按SOD测试盒说明进行,取样量为100μL,用双光束紫外可见分光光度计于550 nm处测定A值,通过公式计算细胞SOD活性。MDA含量测定:采用试剂盒介绍的 TBA法 ,单位为 μ mol/L 。

1.6 统计学分析 所有数据应用SPSS10.0软件处理,参数值用表示,组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 补骨脂、淫羊藿总黄酮对正常兔成骨细胞增殖的影响 试验结果显示,空白组的兔成骨细胞在490 nm处A值为0.175;当补骨脂总黄酮浓度为1.0×10-6g/L、1.0×10-7g/L、1.0×10-8g/L 时,其细胞在490 nm处 A值分别为0.207、0.235、0.230;当淫羊藿总黄酮浓度为 1.0×10-6g/L、1.0×10-7g/L、1.0×10-8g/L 时,其细胞 OD490值分别为0.217、0.241、0.233。补骨脂、淫羊藿总黄酮二组与空白组比较均有极显著性差异(P＜0.01)。且补骨脂总黄酮、淫羊藿总黄酮在浓度为1.0×10-7g/L对成骨细胞增殖效果最佳,见表1。

表1 补骨脂淫羊藿总黄酮对正常兔成骨细胞增殖的影响 (n=8,A490,)

表1 补骨脂淫羊藿总黄酮对正常兔成骨细胞增殖的影响 (n=8,A490,)

**:与空白组比较,呈差异极显著(P＜0.01)

2.2 补骨脂、淫羊藿总黄酮对氧化损伤兔成骨细胞增殖的影响 试验结果显示,模型组细胞减少,A值与空白组相比有显著性差异(P＜0.05)。补骨脂、淫羊藿总黄酮细胞增殖,两组细胞在490 nm处A值分别为0.197、0.208,与模型组相比均有显著性差异(P＜0.05),见表2。

表2 补骨脂淫羊藿总黄酮对氧化损伤兔成骨细胞增殖的影响(n=8,A490:)

表2 补骨脂淫羊藿总黄酮对氧化损伤兔成骨细胞增殖的影响(n=8,A490:)

*:与空白组比较,呈显著性差异(P＜0.05);△:与模型组比较,呈显著性差异(P＜0.05)。下表同

2.3 补骨脂、淫羊藿总黄酮对细胞培养液中SOD活性及MDA含量的影响 试验结果显示,H2O2所致氧化损伤模型组中SOD活力为7.56 U/m,MDA含量为3.54 nmol/mL,模型组与空白对照组相比均有显著性差异;补骨脂、淫羊藿总黄酮组SOD活力增加及MDA含量降低,与模型组比较均有显著性差异,见表3。

表3 补骨脂淫羊藿总黄酮对SOD活性及MDA含量的影响 (n=6)

3 讨论

3.1 补骨脂具有温肾助阳、纳气、止泻的功效;现代医学研究发现其有免疫调节作用、抗肿瘤、促进成骨细胞增殖、平喘等作用。淫羊藿具有益精健骨、补肾作用、能促进造血功能、免疫功能及骨代谢,具有抗衰老、抗肿瘤等功效。根据“肝主筋,肾主骨”的中医理论,肾精不足,肾气虚衰是导致原发性骨质疏松的重要原因,用来治疗骨质疏松症的中医药组方多从补肾入手,调节人体阴阳平衡,补气助阳,强筋健骨[8]。骨质疏松症(OP)是以骨量减少、骨组织显微结构退化为特征,以致骨的脆性增高而骨折危险性增加的一种全身代谢性骨病[9]。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,成骨细胞增殖受抑制及分化程度降低,是造成骨质疏松症的重要原因之一。只有成骨细胞不断增殖及分化才能产生丰富的骨胶原蛋白和非胶原性蛋白质,从而进一步形成更多的骨组织。因此刺激成骨细胞形成的药物可能具有独特的抗骨质疏松的特性。

3.2 MT T比色法[9]测定原理是细胞特别是增殖细胞能量代谢旺盛时,在线粒体能量代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的四甲基氮唑盐MT T还原成为蓝紫色不溶于水的结晶,形成的结晶与增殖的细胞数成正比,其最大吸收峰在490 nm处,用该波长测定溶液吸光度值(A值)能直接反应活细胞的数量和其新陈代谢强度。本次试验应用MTT比色法测定不同浓度的淫羊藿、补骨脂总黄酮对成骨细胞的增殖影响,结果发现,淫羊藿、补骨脂对成骨细胞的增殖均有明显效果,与空白对照组相比有极显著差异,在1.0×10-7g/L效果最佳。

3.3 黄酮类化合物亦称类黄酮或生物类黄酮,主要是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物,目前黄酮类化合物已达8000多种[10]。黄酮类化合物的结构特点是皆有一个三环的核心,其基本结构式由两个苯环(A和B)通过中间杂环的吡喃或吡喃酮(C)相连接[11-12]。黄酮类化合物特殊的结构赋予它一系列独特的化学性质,如能与多种金属离子发生络合或静电作用;具有还原性和捕获自由基的特性;能与蛋白质结合;具有两亲结构和诸多衍生化反应活性等等。黄酮类物质所具有的优秀的抗氧化活性正是这些基本化学性质的综合体现。本次试验证明淫羊藿、补骨脂总黄酮能减少兔成骨细胞氧化损伤,起到抗氧化保护作用,提示淫羊藿、补骨脂补肾健骨作用可能与其总黄酮抗氧化减少成骨细胞氧化损伤有关,其机理有待进一步探讨。

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