张 明

(菏泽学院生命科学系,山东 菏泽 274015)

山参为五加科植物人参的干燥根,含多种皂苷和多糖类成分,产于吉林长白山脉、辽宁、黑龙江、河北、山西;三七参为五加科人参属植物的干燥根,具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效;西洋参为五加科植物西洋参的干燥根,产于吉林长白山脉、福建、云南等高海拔山区,具有补气养阴,清热生津。人参的研究主要集中在成分分离及药理和性质上[1-3],而对于其免疫和抑菌效果鲜有报道[4-6]。本试验对不同种属参多糖进行比较研究,旨在为不同种属参多糖中草药的开发和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人参:分别来源于云南大理的三七参,吉林长白山的西洋参,吉林长白山山参;小鼠购于菏泽医学专科学校实验动物中心,常规饲养;鸡购于菏泽市大和养鸡场;金黄色葡萄糖菌、大肠杆菌和链球菌来源于本系微生物培养室。

1.2 仪器和试剂 DG-3022型酶联免疫检测仪,国营华东电子管厂产品;CO2培养箱,美国 Reveo公司生产;75-2A型微量振荡器,上海医用分析仪器厂生产;恒温培养箱,天津市津北真空仪器厂;倒置显微镜及照相系统(Olympus IX-50),重庆光学仪器厂生产;721紫外分光光度计,上海第二仪器厂;DMEM培养基,Gibco公司产品;伴刀豆素球蛋白(ConA),Sigma公司产品;血清脂肪酶(LPS),Sigma公司产品;四甲基偶氮唑蓝(MT T),Amresco公司产品;淋巴细胞分离液;裂解液:二甲基亚砜(DMSO)分析纯,苏州正兴化工研究院产品。

1.3 人参多糖的提取 人参用水冲洗干净,烘干粉碎成粗粉,乙醚脱脂回流,烘干,脱脂人参干粉分别称5 g,按1∶20料液比,温度为100℃,索式提取器回流提取2次,合并滤液,减压浓缩,80%乙醇终浓度(V/V)沉淀24 h,3000 r/min离心,烘干,称量定容,硫酸苯酚法测吸光度(y=1.546x-0.1444 R2=0.9946),计算粗多糖含量及多糖率[多糖含量(%)=(C样×250×10-3)/W样×100%;其中:C样表示标准曲线上查得的样品浓度W样表示称取的粗多糖样品质量多糖提取率(%)=(粗多糖提取物总质量×样品多糖含量)/板蓝根粉质量]。

1.4 巨噬细胞的吞噬试验 取小鼠20只,雌雄各半,随机分为4组:试验组Ⅰ(三七参多糖)、试验组Ⅱ(山参多糖)、试验组Ⅲ(西洋参多糖)、试验组Ⅳ(生理盐水),其中Ⅳ为对照组,每天对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别腹腔注射0.5mL浓度为2 mg/mL多糖溶液,连续免疫7 d,对照组则注射等量生理盐水。第8天,腹腔注射1mL 2%鸡细胞悬液,30 min后颈椎处死小鼠,无菌注射2mL生理盐水到腹腔中揉匀5 min后取腹腔液,调细胞浓度为 2×105/mL,取300μL于载玻片上置湿盒内37℃培养箱中贴附30 min,取出后用37℃预热的PBS冲洗未被吞噬的鸡红细胞,立即置甲醇溶液中固定3 min,姬姆萨染液染色20 min,晾干观察,计算吞噬率和吞噬指数。

1.5 淋巴细胞转化试验 取3只小鼠颈椎处死,无菌取脾脏,用灭菌生理盐水冲洗3次,放入含 Hank′s液的平皿中剪碎。装入100目网孔的尼龙网袋中。用弯针头挤压过滤收集细胞液,加入淋巴细胞分离液,2000 r/min离心20 min,吸取中间云雾状白细胞层。用Hank′s液洗2次。用DMEM 营养液稀释成1×106/mL的细胞悬液,分别向细胞悬液中加入ConA和LPS(终浓度为5μg/mL),然后加入到96孔细胞培养板中每孔 100μL,再分别加入不同地区人参多糖 100μL,每种浓度重复4孔。另设ConA和LPS的对照孔,细胞调零孔。将细胞板放入37℃、5%CO2培养箱中培养44 h。每孔中加入20μL MTT液,继续培养4 h取出,各孔吸出上清液,加入100μL裂解液,在微量震荡器上混匀使其颜色变澄清,用酶联免疫仪检测570 nm下的吸光度作为淋巴细胞增殖的指标(OD570 nm)。

1.6 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的检测

1.6.1 最低抑菌浓度(MIC)检测 按试管2倍稀释法进行,取7支高压灭菌试管,各管分别加入营养肉汤1mL,在第1管中加入试验试剂1mL,混匀后吸取1mL加入到第2管中,第2管按同样方法混匀后吸取1mL加入到第3管,依次稀释至第6管,第6管混匀后弃去1mL,第7管不加药液作对照。各管分别加入用生理盐水稀释成含菌量为108CFU/mL的试验菌液,混匀,37℃培养 24 h,摇匀,将各管中的液体用接种环接种于平板培养基中,轻轻将菌液摊开,37℃培养20 h,观察结果。每株受试菌株进行2次重复试验。平板上明显有细菌生长而出现菌落的判断细菌生长阳性,无菌落者判断细菌生长阴性。以抑制细菌生长的药物最低浓度为MIC。

1.6.2 最低杀菌浓度(MBC)的检测 测出MIC后,在依次从未见细菌生长的各试管培养物中分别吸取0.1mL,接种于不含药的平皿琼脂培养皿中,轻轻摊开菌液,37℃培养24 h,观察结果。判定标准为生长菌落数小于5的药液最低浓度为MBC。

2 结果与分析

2.1 不同种属人参多糖对小鼠吞噬功能的影响。见表1。

表1 小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数(D)

表1 小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数(D)

注:同一列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)

从表1可以看出,不同种属的人参多糖与对照相比吞噬百分率和吞噬指数差异均达到显著水平(P＜0.05),不同种属的人参多糖之间有一定差异,西洋参多糖吞噬百分率显著高于三七参多糖和红参多糖,而三七参多糖和山参多糖之间差异不显著,对于吞噬指数各多糖差异不显著。

2.2 不同种属人参多糖对小鼠脾脏淋巴细胞增值的影响。见表2。

表2 不同种属参多糖对体外小鼠脾脏淋巴细胞增值的影响(OD570 nm,n=3)

由表2可知,与对照组相比较,除山参多糖+LPS外,其他多糖和ConA或LPS相互作用对小鼠脾淋巴细胞增殖均达到显著水平(P＜0.05),西洋参多糖协同促进作用明显,而单独人参多糖之间淋巴细胞增殖无显著差异,说明人参多糖不能对小鼠淋巴细胞产生直接促进作用。

2.3 不同种属人参多糖最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。见表3,表4。

表3 3种参多糖对4种细菌的最低抑菌浓度(MIC)(g/mL)

3种不同种属的人参多糖对支原体、链球菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用。其中三七参和山参多糖对金黄色葡萄球菌和支原体的抑制作用较强,MIC均为0.125 g/mL;对大肠杆菌和链球菌,药物浓度为0.250 g/mL时有部分抑制作用,其MIC均为0.500 g/mL.西洋参多糖浓度为0.125 g/mL时对葡萄球菌、链球菌有部分抑制能力;对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用较弱,MIC分别为0.500 g/mL,0.250 g/mL。

表4 3种参多糖对4种细菌的最低杀菌浓度(MBC)(g/mL)

由表4可知,西洋参多糖在0.125 g/mL时几乎能够杀死大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、支原体和链球菌;山参多糖浓度为0.125 g/mL时能杀死支原体和大肠杆菌,对链球菌、金黄色葡萄球菌的MBC组为0.250 g/mL;而三七参多糖效果相对较差,对链球菌的MBC为0.500 g/mL。

3 讨论

人参多糖具有免疫调节作用,对特异性免疫和非特异性免疫均有一定的促进作用,巨噬细胞是机体非特异性免疫的关键细胞,它承担着摄取处理和提呈抗原的重要作用,并直接对靶细胞产生特异性的杀伤作用[7]。巨噬细胞表面有多种介导细胞间相互作用的受体,而多糖能通过多糖受体使巨噬细胞活化[8],激活的巨噬细胞可以增强淋巴细胞的免疫生物学活性从而达到抗菌消炎、抗内毒素、抗肿瘤,还有促进机体免疫中都有重要作用。

细胞增殖试验是测定免疫细胞功能的方法之一,淋巴细胞受到各种因子刺激时会发生细胞增殖。在细胞增殖过程中细胞的代谢处于旺盛状态。细胞增殖需要大量的能量,以供合成各种大分子物质和完成分裂过程,因此细胞能量代谢的水平往往可以间接反映细胞增殖情况,Mosmann根据这一原理首创了MT T比色分析方法[9]。小鼠T淋巴细胞未经ConA刺激时处于Go期(静止期),ConA可以诱导T淋巴细胞表达IL-2受体,使T淋巴细胞活化;也可以使T淋巴细胞从Go期进入G1期(DNA合成前期)。LPS是B细胞的分裂原,直接刺激B细胞发生有丝分裂为B细胞的多克隆激活剂[10]。据梁中琴等[11]报道灵芝多糖能刺激人外周血淋巴细胞从G1期进入S期并可使CD4+细胞数量明显升高,CD4+/CD8+细胞比例增加。林志彬[12]研究表明,灵芝多糖可通过间接激活淋巴细胞中的DNA多聚酶促进DNA合成及T淋巴细胞增殖。本研究试验结果表明:不同产地人参多糖对未经ConA或LPS刺激的静息期细胞没有明显的促增殖作用,然而对ConA活化的小鼠T淋巴细胞能促进增殖,表明两者有协同作用,同样对于LPS激活的B淋巴细胞同样能促进细胞增殖。提示人参多糖对T、B淋巴细胞均具有促进有丝分裂的作用是一种理想的免疫刺激剂。

支原体、链球菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌几乎存在于所有的哺乳动物体内,特别是畜禽类,可以导致各种疾病。本试验研究结果表明,不同种属的人参多糖都呈现出一定的抗菌和杀菌能力,特别是西洋参多糖具有较强的抑菌能力和杀菌能力,对于其机理有待进一步研究。

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