张黎明,张丽娜,李志鹏,徐世文

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江 哈尔滨 150030)

1931年,Kemmem等首先发现锰为大鼠、小鼠维持正常生长和生殖性能所必需。锰作为动物体内一种必需微量元素,参与机体糖代谢、脂肪代谢、凝血机制、生长发育、神经及内分泌系统等活动,同时锰也是一种常见的职业和环境污染物[1-3]。目前人们对锰毒性的研究多注重在神经系统方面,近几年来,随着生殖毒理,生殖流行病学和生殖生化领域研究的发展,锰对生殖系统的损害已渐渐受到了人们的重视[4]。但是锰的生殖毒性研究主要集中在人和鼠上,未见有关禽类的相关报道。本试验通过在饲料中添加不同剂量的氯化锰,复制亚慢性锰中毒模型,通过检测鸡睾丸组织DPC含量的变化,探讨锰致鸡睾丸细胞DNA的损伤作用,为研究锰的毒性机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理 健康50日龄海蓝褐公鸡240只随机分成4组,每组60只,对照组饲喂基础日粮,低剂量组饲喂基础日粮+500 mg/kg MnCl2,中剂量组饲喂基础日粮+800 mg/kg MnCl2,高剂量组饲喂基础日粮+1700 mg/kg MnCl2,分笼常规饲养。分别与染锰后 30、60 d和 90 d时,每组随机抽取5只剖杀,取睾丸组织检测相应指标。

1.2 主要试剂和仪器 氯化锰(天津博迪化工),十二烷基硫酸钠(SDS),蛋白酶K(Merk公司),Hoechst33258荧光染料(Sigma公司),小牛胸腺DNA(Sigma公司),其余化学试剂皆为国产分析纯。7230G可见光分光光度计(上海分析仪器总厂),970CRT荧光分光光度计(上海棱光精密科学仪器有限公司),F0630低温高速离心机(德国BAKEMAN公司)。

1.3 DPC含量的检测 采用KCl-SDS沉淀法进行检测[5-7]。先制作DNA浓度的标准曲线:用清洗缓冲液配制终浓度分别为0、100、300、500、750、1000、1500、2000、3000、5000 ng/mL 的小牛胸腺 DNA标准液,即加入1mL新鲜配制的400 ng/mL的荧光染料Hoechst33258,使其终浓度为200 ng/mL,置于暗处30 min,然后用970CRT荧光分光光度计仪在350 nm激发光和450 nm发射光下测得各浓度的荧光值,制备标准曲线(图1),回归方程为:y=0.7202x+4.9392,r2=0.9996。将染色后的样品用970CRT荧光分光光度计测定其荧光值,并根据标准曲线来定量交联DNA和自由DNA,再计算DPC系数η。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS 13.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 睾丸组织中DPC含量的检测结果 由表1可知,在不同时间点随着染毒剂量的加大,染毒组DPC含量呈上升趋势;在各时间点,各染毒组与对照组比较除30 d、60 d低剂量组与对照组差异不显著外(P＞0.05),其他各染毒组与对照组间均差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01),各染毒组间除60 d、90 d中剂量组与高剂量组差异不显著外(P＞0.05),其他各组差异均显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。

2.2 生精细胞凋亡指数的检测结果 由表2可知,在锰中毒90 d时,生精细胞凋亡的数量均由对照组到高锰组逐渐增加,各剂量组间差异均极显著(P＜0.01)。

表1 睾丸组织中DPC含量的测定

表2 生精细胞的凋亡指数

3 讨论

DNA-蛋白质交联(DPC)环境理化因素对生物大分子物质的一种重要遗传损害,已有研究发现许多环境污染物和化学致癌物包括甲醛、烷化剂、砷化合物以及一些重金属如镉、镍等均可引起DPC[8]。与其他类型的DNA损伤相比,DPC较难修复,易造成一些重要的基因丢失[9]。正常细胞中存在着一定数量的 DPC,但 DPC过量增加则是一种病理现象[10]。

锰是一种常见的环境和职业污染物,具有生殖遗传毒性[11]。王子元等[12]通过给小鼠腹腔注射氯化锰染毒,研究锰对雄性生殖细胞的遗传毒性,结果显示,无论显性致死试验中的平均死胎数和突变指数还是睾丸染色体畸形分析,染毒组与对照组比较都有显著差异,说明锰对雄性生殖细胞有遗传毒性。本试验中随着染毒剂量的加大及染毒时间的延长,在不同的时间点各染毒组与对照组相比都可以显著诱导DPC效应和生精细胞细胞凋亡的发生,并且存在明显的时间剂量效应,另外通过剖检变化、组织切片的光镜和电镜观察睾丸组织,发现染锰组鸡只睾丸体积与对照组相比出现不同程度的缩小,光镜观察可见曲细精管内精原细胞排列紊乱、支持细胞,有的曲细精管萎缩、变形,生精上皮变薄,各级生精细胞减少或缺如,部分脱落至管腔,部分管腔可见坏死细胞碎片,染锰组鸡只睾丸超微结构发生形态改变,部分生精细胞核皱缩,染色质浓集、边聚,核膜间隙大,核仁凝聚成团,间质细胞核浓缩,核与核膜分离,线粒体肿胀,嵴模糊,形成空泡、部分内质网肿胀,说明锰中毒可造成显著的DPC效应,阻碍DNA复制与转录,造成DNA复制过程中某些基因的丢失,严重损伤DNA,进而可引发生精细胞凋亡,由此对睾丸组织发育和精子生成产生损害。然而DPC是否可以作为锰暴露和遗传毒性的生物标志物还需进一步的研究证明。

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[12]王子元,李玉贵,林磊光,等.氯化锰对雄性小鼠生殖细胞诱变性的研究[J].中国工业医学杂志,2002,15(1):8-12.