贾俊涛,陈立军,赵明秋,琚春梅,吕英然,陈金顶

(华南农业大学兽医学院,广东 广州 510642)

口蹄疫(FMD)是引起偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]。目前,使用传统灭活疫苗免疫和扑杀相结合仍是防控口蹄疫的主要措施。但是仍然不能控制口蹄疫病毒(FMDV)的感染与传播,这就促使人们寻求有效的措施防控口蹄疫。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是最近几年发展起来的一种新的能在体外有效抑制病毒复制的方法,是由与靶基因序列同源的dsRNA引发的广泛存在于动植物中的序列特异性基因转录后的沉默过程[2]。腺病毒载体因具有感染细胞种类多、感染效率高、外源基因表达水平高且既适于体外又适于体内研究等特点而被作为转基因载体[3]。本研究成功构建了携带有O型FMDV VP1基因 siRNA片段的重组腺病毒质粒,并转染 HEK293细胞,获得了重组腺病毒。观察携带有FMDV基因siRNA片段的重组腺病毒在细胞水平对FMDV复制的抑制效果,从而对腺病毒介导的RNAi抑制FMDV增殖的作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞和毒株 质粒 pSIREN-shuttle、pAdeno-X,细胞 HEK293、IBRS-2 和 FMDV O/HKN/2003由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保存。

1.2 引物设计与合成 根据pAdeno-X序列和PISce I、I-Ceu I的识别序列,设计如下引物:P1:5′-CGGGAAAACTGAATAAGACG-3′;P2:5′-CATCAAACGAGT TGGTGCT-3′。

1.3 siRNA表达质粒的获得 根据 siRNA的设计原则[4],选择VP1基因保守序列作为可能的干扰位点,合成了含有siRNA序列的寡核苷酸片段,将其克隆到pSIREN-Shuttle中,经过鉴定获得阳性克隆。

1.4 重组腺病毒的获得 将1.4中的重组质粒及pAdeno-X分别进行 I-Ceu I、PI-Sce I双酶切,连接酶切产物,转化DH5α。以P1、P2为引物进行质粒PCR,筛选阳性克隆。PCR条件:94℃5 min,94℃45 s,50℃45 s,72℃1 min,30个循环;72℃延伸10 min。并采用Pac I酶切及测序鉴定,得到阳性重组质粒pAdeno-VP1。

1.5 重组腺病毒的包装及扩增 制备pAdeno-VP1,Pac I酶切,然后转染HEK293细胞。转染后20d出现明显的CPE,经PCR扩增鉴定,获得了重组腺病毒rA-deno-VP1,并进行重组腺病毒的纯化和滴度测定。

1.6 重组腺病毒抑制FMDV在IBRS-2中的复制将rAdeno-VP1以MOI=10的量感染IBRS-2细胞,吸附 12 h后,加入 100TCID50的 FMDV O/HKN/2003,观察细胞变化,并在BHK-21细胞上测定感染 FMDV 12 h、24 h 、36 h 、48 h、60 h 、72 h 时细胞培养上清中FMDV的TCID50。

2 结果

2.1 重组腺病毒质粒pAdeno-VP1的鉴定 以提取的质粒为模板进行质粒PCR鉴定,扩增出600 bp左右大小的条带,与预期相符(图1)。将可能的阳性重组子用 Pac I酶切后出现两条亮带,一条在3000 bp左右,另一条在30 kb左右,与预期相符(图2)。将质粒PCR鉴定为阳性的 pAdeno-VP1进行序列测定,结果与预期序列完全吻合。结果表明,重组质粒构建成功。

2.2 腺病毒的包装及增殖 重组腺病毒质粒经Pac I酶切线性化后,转染HEK293细胞后第7～10天开始出现CPE,以后几天CPE在逐渐增加;在质粒转染后15～20 d,细胞出现完全病变,大量细胞脱壁浮起,细胞聚集呈葡萄串状(图3),20 d时CPE细胞可达到80%～90%,收获病毒。

图3 重组腺病毒质粒转染16 d时的293细胞(200×)

2.3 重组腺病毒rAdeno-VP1基因组DNA的PCR鉴定 转染获得包装病毒后,取增殖到第3、7、10代重组腺病毒提取病毒总DNA做为PCR扩增的模板,以 P1/P2作为引物进行 PCR,均扩增出598 bp大小的条带,而正常的HEK293细胞无条带(图4)。证明重组腺病毒包装成功并进行了增殖。

图4 重组腺病毒rAdeno-VP1 PCR鉴定

2.4 重组腺病毒的增殖、纯化及滴度测定 用经过鉴定正确的rAdeno-VP1感染293细胞以大量增殖病毒,一般在感染后3～5 d出现明显的CPE,离心收集细胞。纯化后,获得纯化病毒液。用终点稀释法计算出病毒滴度为2.5×109PFU/mL。

2.5 重组腺病毒抑制FMDV在IBRS-2中的复制rAdeno-VP1和FMDV共感染IBRS-2细胞后12 h、24 h、36 h、48 h 、60 h 、72 h 观察 CPE 情况,并测定细胞上清中FMDV的TCID50。结果显示:感染10 MOI rAdeno-VP1的 IBRS-2细胞,在 72 h之内无明显的CPE。细胞上清液病毒滴度测定结果与细胞形态学观察结果相符,细胞上清中FMDV的病毒滴度较低,而病毒对照的病毒滴度相对较高(表1)。说明重组腺病毒能够抑制FMDV在IBRS-2细胞中的复制。

表1 不同时间细胞上清中FMDV滴度(TCID50/100μL)

3 讨论

口蹄疫是目前危害世界养殖业的重要疫病之一。尽管FMDV灭活疫苗已成为防治该病的重要手段之一,但其免疫效果仍不够理想。RNA干扰是近年来产生的一项新的研究基因表达、调控和功能的生物技术,迅速发展的RNAi技术已经使其成为一种功能强大的研究动物特定基因表达和功能的工具[2]。迄今为止,有大量文献表明,通过人工转染siRNA能够有效地诱发 RNAi抵抗病毒的感染[5-6]。本研究选择了FMDV VP1基因保守序列作为可能的干扰位点,合成了含有相应siRNA序列的寡核苷酸片段。VP1基因在病毒复制周期中发挥重要作用,是理想的siRNA靶标,因此,如果VP1基因的表达被抑制,就会抑制病毒的增殖。

RNAi表达载体有质粒载体[7]和病毒载体[8-9],其中病毒载体克服了质粒转染细胞效率低的缺点,并可体内应用,可实现长时间的靶基因沉默,具有临床应用前景等优势。本研究采用的就是复制缺陷型腺病毒载体,用HEK293细胞作为包装细胞,用脂质体转染的方法成功构建了携带有FMDV VP1基因siRNA片段的重组腺病毒。并使用纯化试剂盒进行了纯化,获得了较高滴度Adeno-X重组腺病毒,为腺病毒介导的RNAi抑制FMDV在细胞中的复制打下了基础。

口蹄疫病毒的基因组是一条单链RNA,其既作为mRNA又作为复制模板行使功能,因此口蹄疫是利用RNA干扰技术防制的理想对象。本研究选用的细胞是猪肾细胞IBRS-2,重组腺病毒只能感染该细胞,但不能在细胞内进行复制,而FMDV则能在IBRS-2细胞内复制增殖。所以我们用重组腺病毒和FMDV共感染IBRS-2细胞,通过观察细胞变化情况及测定细胞上清液中FMDV的病毒滴度来检测腺病毒介导的RNAi抑制FMDV在IBRS-2细胞中复制的效果。我们的研究表明,特异性的siRNA的重组腺病毒能够保护抑制FMDV在IBRS-2细胞中的复制。

[1]Fred Brown.T he history of research in foot-and-mouth disease virus[J].Virus Research,2003,91:3-7.

[2]Famulok M,Verma S.In vivo-applied funcationl RNAs as tools in proteomics and genomics research[J].T rends Biotechnol,2002,20:462-466.

[3]McConnell M J,Imperiale M J.Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy[J].Hum Gene Ther,2004,15:1022-1033.

[4]T ushl T.Expanding small RNA interference[J].Nat Biotechnol,2002,20(5):446-468.

[5]Gitlin L,Andino R.Nucleic acid-based immune sy stem:the antiviral potential of mammalian RNA silencing[J].J Virol,2003,77:7159-7165.

[6]Ding S W.RNA silencing:a conserved antiviral immunity of plants and animals[J].Virus Res,2004,102:109-115.

[7]Brummelkamp T R,Bernards R,Agami R.A sy stem fo r stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J].Science,2002,296:550-553.

[8]Schomber T,Kalberer P C,Wodnar-Filipowicz A,et al.Gene silencing by lentivirus-mediated delivery of siRNA in human CD34+cells[J].Blood,2004,103(12):4511-4513.

[9]Uprichard S L,Boyd B,Althage A,Chisari F V,et al.Clearance of hepatitis B virus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNA s[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(3):773-778.