张谨华 ，王 鑫

（1.晋中学院生物科学与技术学院，山西晋中030600；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

利用微生物的降解作用是清除环境中芳香族化合物污染的有效途径之一[1]。而固定化微生物技术是可将游离细胞定位于材料的限定空间中，并使其保持生物活性且可反复利用的生物技术。由于它具有生物浓度易控制、耐毒害能力强、菌种流失少、产物易分离、运行设备小型化等特点，应用在水处理和生物生产领域中，近年来已成为各国学者研究的热点[2]。但是，由于固定化材料性能的诸多不足，固定化微生物技术的工程应用受到很大的限制，因此，研制优质的固定化材料势在必行[3]。

本研究通过选取未经固定化微生物处理的苯酚废水浓度，采用3种包埋固定化载体作为细菌固定化材料，一种是最优良的凝固剂琼脂，是凝胶包埋法中常用的载体；一种是海藻酸钠，可作为天然高分子载体材料的代表；一种是人工合成的高分子载体材料PVA。分别就3种材料作不包埋微生物的固定化颗粒小球的比较试验研究，确定最佳包埋材料，并在此基础上优化选择包埋条件。

由于制作包埋微生物的固定化颗粒需要对微生物进行培养、离心、作静息细胞，因此本试验尝试采用不包埋微生物的固定化颗粒来选择包埋材料以简化实验操作。

1 材料和方法

1.1 材料

琼脂、海藻酸钠（SA）、聚乙烯醇（PVA 1799+50 AR）均购自华美生物工程公司。

菌种苯酚降解菌Rhodoccocus sp DF51，由山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室筛选并保存。

1.2 配制合成废水

NH4NO30.8 g，KH2PO40.4 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，酵母膏 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.02%（W/V），FeSO4·7H2O0.000 2 g，苯酚 0.8 g，蒸馏水 1 L。pH为6.4。

1.3 制作不包埋微生物的固定化颗粒小球

先配制一定浓度的载体溶液（即4%的纯琼脂水溶液（降温到45℃待用）、3%的海藻酸钠、10%的PVA载体溶液），用预热的无菌20 mL注射器针筒（9号针头）分别加压滴入相应的无菌交联剂溶液中（即液体石蜡油、4%CaCl2水溶液、饱和H3BO3）。交联16 h，制成固定化颗粒小球，用生理盐水洗涤3次，放入4℃冰箱备用[4]。

1.4 比较3种固定化载体的性能

选用20粒粒径大小相同的琼脂小球、海藻酸钠小球和PVA小球，分别浸入装有50 mL合成废水的三角瓶中，放入恒温摇床上作振荡培养（250 r/min，30℃），30 min时测定苯酚残余量（苯酚含量的测定采用4-氨基安替比林比色法[5]），计算不同材料对苯酚的吸附性能（吸附性能=30 min时苯酚含量/0时苯酚含量×100%）。24 h时观察小球的稳定性与合成废水的浑浊度。

1.5 静息细胞

自斜面培养基上挑一环菌接入20 mL初始苯酚浓度为0.2 g/L的基础培养基中，30℃下，200 r/min培养36 h。然后以5%的接种量转接至50 mL初始苯酚浓度为0.5 g/L的基础培养基中，2次活化36 h。再以10%的接种量转接至初始苯酚浓度为0.8 mg/L基础培养基中培养24 h至对数生长期中后期。最后，在4℃，8 000 r/min下，离心10 min。离心收集到的菌体经磷酸缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.0）洗涤 2次后，悬浮在该磷酸缓冲液中，制备成不同细胞浓度的菌悬液。

1.6 固定化细胞的制备，确定海藻酸钠作为载体材料的最佳固定化条件

将制成的菌体干质量浓度为4.4 g/L的菌悬液在4℃下保存。称取适量的海藻酸钠（SA）置于沸水中搅拌使其充分溶解，然后冷却至室温，灭菌。取一定体积的菌悬液和SA溶液混合均匀，使用灭菌过的注射器借助微型注射泵在磁力搅拌状态下将其滴加于一定浓度的CaCl2沉淀剂中，根据溶液的黏度调整微型注射泵的流速和注射器高度得到相同大小的球状颗粒，交联充分后，用无菌生理盐水清洗2～3次，4℃保存。

2 结果与分析

选用3种载体制作固定化颗粒进行比较试验，结果列于表1。

表1 3种固定化载体的相对比较

由表1可知，琼脂、海藻酸钠颗粒在30 min内对苯酚的吸附性能较高，都有较好的传质性能，而PVA的吸附性能相对较低；琼脂颗粒稳定性差，振荡培养24 h后全部破碎，且使合成废水变浑浊，固液不能分离，不能重复使用。综合考虑固定化载体的各项特性得出，海藻酸钠为固定化微生物处理苯酚废水的最好包埋材料。

为确定海藻酸钠作为载体材料最适宜的包埋条件，选择载体（海藻酸钠）浓度、菌体与载体浓度之比、交联剂（CaCl2）浓度为影响因素，每个因素选取3个水平，以正交设计来确定试验方案，各因素与水平的组合如表2所示。此方案中的各种固定化微生物在相同条件下对苯酚进行降解，结果表明，红球菌降解苯酚的最佳固定化条件是方案4，即载体浓度为3%，菌体与载体浓度之比为1∶10，交联剂浓度为3%。此条件下的固定化细胞不仅降解率最高，而且机械强度和韧性也最好。进一步对方案4不同的交联时间（h）进行试验，结果表明，交联时间在10 h以内的机械性能较差，而16 h以上的交联时间，固定化细胞机械强度较好。

表2 不同因素对固定化红球菌降解苯酚的影响

3 结论与讨论

本试验选取目前固定化微生物包埋技术中应用最广、效果较好的载体材料，采用经典的最适宜的包埋条件，从经济和效率角度分析，对不包埋微生物的固定化颗粒进行探索性比较试验。结果显示，海藻酸钠具有制备容易、价格低廉、稳定性较好、传质性能良好的优点，可作为最好的包埋材料。固定化生物技术是通过化学或物理的手段，将游离细胞或酶定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用[6]。活细胞固定化技术由于能简化酶的提取，有效提高酶对温度、底物、溶剂和pH等诸因子的适应性并能反复长期使用，有利于实现连续化、自动化与管道化生产与应用，可以大大提高生产效率，具有运行稳定、可纯化和保持高效优势菌种、反应器生物量大、污泥产生量少以及固液分离效果好等一系列优点。因而，这一新技术自20世纪70年代以来首先在发酵[7]、食品和医药工业领域得到广泛的研究与应用[8]，到80年代初开始在废水处理领域中研究与探索[9]。但是，实际废水是一个复杂体系，除需要选育适合于它的高效菌株外，更需要选择固定化微生物处理废水的包埋材料。进一步选择使用寿命长、性能好、价格低廉的固定化载体等，是使固定化微生物法能够真正应用于实际废水处理必须研究解决的问题。

［1］唐渭，苏凤，曾晓东.固定化微生物废水处理技术及其发展[J].环境研究与监测，2006，19（1）：8-10.

［2］Bala Kiran，Anubha Kaushik，Kaushik C P.Response surface methodological approach for optimizingremoval of Cr（VI）from aqueous solution usingimmobilized cyanobacterium[J].Chemical EngineeringJournal，2006，23（6）：1-7.

［3］王彩冬，黄兵，罗欢.固定化微生物技术及其应用研究进展[J].云南化工，2007，34（4）：79-82.

［4］程树培.环境生物技术实验指南[M].南京：南京大学出版社，1995：116-121.

［5］周德庆，胡宝龙，祖若夫，等.微生物学实验教程[M].2版.北京：高等教育出版社，2006：292-293.

［6］王洪祚，刘世勇.酶和细胞的固定化 [J].化学通报，1997（2）：22-27.

［7］陈智理，杨昌鹏，郭静婕.固定化酵母发酵生产果酒研究进展[J].安徽农业科学，2009，37（29）：14357-14359.

［8］王静，于宏伟，李宁，等.阳离子交换树脂D151固定化乳糖酶研究[J].河北农业大学学报，2006（4）：64-68.

［9］吴光前，王丽萍.固定化微生物废水处理技术的现状和前景[J].污染防治技术，2003，16（4）：80-83.