闻公灵 娄季宇 白宏英

1)河南南阳市中心医院神经内科 南阳 473009 2)郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014

缺血性脑血管病病理过程复杂。脑缺血再灌注损伤发生、发展的分子机制的研究,一直是近年来神经科学的研究热点。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)能减少缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的发生,为了解其作用机制,本实验通过建立大鼠脑缺血再灌注模型探讨bFGF对脑缺血再灌注损伤后热休克蛋白70(heat shock protein-70,HSP-70)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达的影响及其与神经细胞凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组选择体质量为270～320 g的健康SD大鼠,雌雄各半(由河南省实验动物中心提供),随机分成假手术组,缺血再灌注组,bFGF组,每组 8只。

1.2动物模型制作用体积分数为10%的水合氯醛300 mg·kg-1麻醉,采用 Longa等[1]的线栓法建立大脑中动脉(MCA)闭塞模型。缺血再灌注组及bFGF组均给予缺血1 h再灌注24 h,届时灌注取脑、固定、脱水、透明、包埋。假手术组除不插线外,余同上。

1.3给药方法bFGF为北京双鹭药业股份有限公司研制,用注射用水稀释,bFGF组腹腔注射10μ g·kg-1,其余组腹腔注射等量生理盐水,缺血后即刻给药。

1.4免疫组织化学染色检测HSP-70和Caspase-3采用SABC法石蜡切片常规脱蜡至水,过氧化氢封闭,抗原热修复20 min,血清封闭,滴加 1∶100兔抗 HSP-70抗体、兔抗Caspase-3抗体(购自中山生物试剂公司),4℃过夜,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate bufferad satine,PBS)洗,滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1h,PBS洗,滴加ABC复合物37℃孵育1 h,PBS液洗,DAB显色,镜下控制反应时间,双蒸水终止反应,脱水、透明、封片、显微镜观察。10×40倍光镜下,在缺血区计数5个视野,计数阳性细胞数,取其均值,以阳性细胞数/高倍视野表示。

1.5 T UNEL法原位检测凋亡细胞T UNEL试剂盒购自武汉Boster生物工程公司。从每只大鼠的连续切片中随机抽取,参考试剂盒说明书进行T UNEL法染色检测凋亡细胞。简述如下:石蜡切片脱蜡至水,0.2%蛋白酶K消化30 min,TdT反应液37℃湿盒孵育60 min,生物素化抗地高辛抗体于37℃反应30 min,SABC法染色,最后DAB显色,苏木素复染,封片后光镜观察。在光镜400倍视野下在缺血区计数5个视野,计数阳性细胞数(镜下核染色棕黄色),以均值作为阳性细胞数。

1.6统计学处理采用SPSS 12.0统计分析软件进行处理,数据以均数±标准差(s)表示,组间比较采用 t检验。取α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1缺血再灌注后各组脑细胞组织学变化假手术组神经元形态正常,结构完整,未见坏死细胞,无间质水肿。缺血再灌注组在基底节,皮质下白质和皮质区可见明显梗死灶,神经元胞体肿胀核碎裂、溶解,核固缩,胞浆染色变淡细胞间隙增宽,间质水肿明显。bFGF组梗死灶也位于基底节及皮质下白质,部分累及皮质,多数神经元结构较完整,形态相对正常,间质水肿轻。

2.2细胞凋亡和Caspase-3蛋白检测结果光镜下,凋亡细胞核呈棕黄色,染色质聚集,靠边形成环状、斑块状或新月体状,可见凋亡小体形成;HSP-70及Caspase-3阳性细胞胞浆呈棕黄色,三者主要分布于梗死灶边缘区。假手术组偶见凋亡细胞HSP-70和Caspase-3阳性细胞,bFGF组凋亡细胞数和Caspase-3阳性细胞数明显低于缺血再灌注组(P＜0.05和P＜0.05),bFGF组hsp-70阳性细胞数明显较缺血再灌注组增加(P＜0.05)。见表1。

表1 2组凋亡细胞和Caspase-3阳性细胞数比较

3 讨论

神经细胞死亡是脑梗死的病理基础。近年来研究发现,脑缺血再灌注损伤可诱导神经元凋亡。大鼠缺血再灌注30 min即可出现细胞凋亡,24～48 h凋亡的细胞最多,可一直持续到28 d[2]。本实验观察到,缺血1 h再灌注24 h,缺血区可见成簇核被染成棕黄色的凋亡细胞。

Caspase-3是Ced-3相关半胱氨酸蛋白酶,被认为是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶,是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路[3]。有研究发现,缺血可使脑组织Caspase-3表达增加,Caspase-3过度表达可导致神经细胞凋亡[4],在缺血性神经损伤过程中,抑制Caspase-3活性可产生明显的神经保护作用[5]。本实验应用免疫组化法观察缺血1 h再灌注24 h皮质区Caspase-3的表达,发现假手术组在相当于损伤区皮质,偶见Caspase-3阳性细胞,缺血再灌注组Caspase-3阳性细胞明显增多且与凋亡细胞分布一致。虽然bFGF组Caspase-3阳性细胞仍较多,但较缺血再灌注组相比,明显减少(P＜0.05),提示bFGF能通过抑制Caspase-3的表达而减少细胞凋亡的发生。

bFGF是一种重要的神经营养因子,广泛分布于成熟和未成熟的中枢神经系统内,通过与其相应受体结合发挥神经保护作用。Li等[6]在大鼠MCAO后2 h,静脉给予bFGF,缺血24 h区皮质梗死面积缩小32%,且神经功能缺损症状明显改善。Sugimori等[7]研究bFGF对缺血脑组织的远期影响,发现bFGF能使大鼠pMCAO 3个月后脑组织梗死体积降低27%。我们的实验观察到bFGF能使缺血区神经元凋亡数显著减少(P＜0.05),改善缺血区脑组织病理学变化,减轻脑水肿。但其作用机制尚不十分明了。

HSP-70是一类应激保护性蛋白,正常脑组织HSP-70含量极少,当受到有害刺激时,受损细胞内的变性蛋白可诱导HSP-70表达[8]。脑缺血再灌注后HSP-70表达上调是神经元遭受可逆性损害的一种代偿性修复机制,其表达水平被认为是细胞受损敏感的指标。本实验结果表明:脑缺血再灌注后24 h,脑缺血再灌注区HSP-70阳性细胞明显增多。bFGF组与缺血再灌注组之间在HSP-70阳性细胞表达上存在明显的变化,bFGF提高了HSP-70的表达。实验观察到bFGF组病灶区多数神经元结构较完整,形态相对正常,间质水肿轻,提示HSP-70在脑缺血再灌注损伤后应激保护作用中起到重要作用,bFGF能有效上调HSP-70的表达,抑制细胞凋亡,减轻脑组织损伤,增强细胞对缺血再灌注的耐受性。HSP-70抗细胞凋亡作用的具体机制较复杂,尚需进一步研究,抑制Caspase-3的活化可能是其作用之一。

[1]Longa EZ,Weinsein P R,Canson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion with craniectony in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]M allei A,Aden SA,Bachis A,et al.The nitrosteroid NCX 1015,a prednisolone derivative,improves recovery of function in rats after spinal cord injury[J].Brain Res,2005,1062(1/2):16-25.

[3]Neumar RW.Molecular mechanisms of ischemic neuronal injury[J].Ann Emerg Med,2000,36(5):483-506.

[4]Loetscher H,Niederhauser O,Kemp J,et al.Is caspase-3 inhibition a valid therapeutic strategy in cerebral ischemia[J].Drug Discov Today,2001,6(13):671-680.

[5]Li Q,Stephenson D.Postischemic administration of basic fibroblast g rowth factor improves senso rimoter function and reduces infarct size following permanent focal cerebral ischemia in the rat[J].Exp Neurol,2002(2),177:531-537.

[6]Sugimori H,Speller H,Finklestein SP.Intravenous basic fibroblast growth factor produces a persistent reduction in infarct volume following permanent focal ischemia in rats[J].Neurosci Lett,2001,300(1):13-16.

[7]卢艳秋,娄季宇,白宏英,等.托吡酯对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和HSP-70表达的影响[J].中国实用神经疾病杂志,2007,10(3):86-88.