卢月梅,张阮章,胡玉华,钟运华,武学成,陈升汶,王沙燕

随着抗生素的大量使用,病原菌产生多种耐药机制以逃避抗生素的攻击。β-内酰胺类抗生素是临床上用得最多的抗生素,产生β-内酰胺酶是细菌对该类抗生素耐药的最重要和最常见的机制。由于β-内酰胺酶编码基因的突变,导致新型β-内酰胺酶的不断出现。LEN-5为本研究组首次发现于深圳市人民医院临床分离株的β-内酰胺酶(GenBank登录号为AY790341)〔1〕。为了进一步研究酶的特性,本研究对LEN-5基因进行原核表达。现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 含LEN-5质粒由深圳市人民医院临床分离株中获得;pET26b(+)表达载体购于默克公司、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌 BL21(DE3)购自上海生工,SHV-1型标准产酶菌由陈民均教授惠赠。

1.1.2 主要试剂 PCR引物由Invitrogen公司合成,限制性内切酶 Nde I、Xho I、T4连接酶、高保真Pfu DNA聚合酶为Fermentas公司产品、胶回收试剂盒为QIAgen公司产品、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、质粒提取试剂盒为BBI公司产品;Nitrocefin购自基因公司,两性电解质载体凝胶(pH3～10)为Bio-Rad公司产品。等电点标准(pH 3～10)为Amersham公司产品。凝胶纯化试剂盒(QIAquick Gel Extraction kit)为 QIAgen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增LEN-5基因 根据LEN-5编码基因序列(gb|AY790341)设计PCR引物并分别引入Nde I和Xho I酶切位点。正向引物:5 -ATTGTGCATATGCGT TATATTCGCCTGTGTATTAT(划线为 Nde I酶切位点),反向引物:5 -ATACTGCTCGAGGCGTTGCCAGTGCTCGATC(划线为 Xho I酶切位点)。以含LEN-5基因的质粒DNA为模板进行 PCR反应。PCR反应条件为:95℃5min,接着 94℃45s、58℃45s、72℃60s,共 30个循环,72℃延伸 10min。目的PCR产物为879bp。设大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照,SHV-1型标准产酶菌为阳性对照。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,用凝胶成像系统观察结果并照相。

1.2.2 pET-26b(+)/LEN-5重组质粒的构建……