周永运,许彦梅,崔志刚,金 东,赵爱兰,叶长芸,徐建国

肠球菌是院内常见条件致病菌,腹泻标本有时也可分离到该菌,经常被认为是菌群失调的结果。为了解该类标本分离肠球菌菌株的克隆特征,进行了16S rRNA和PFGE方法以进一步分析。

1 材料及方法

1.1 样本特征及来源 与山西省临床检验中心合作,从太原市某医院采集儿童腹泻粪便标本,其中4例腹泻病患者的标本初步培养以肠球菌为优势菌群,腹泻儿童的病历材料见表1。

1.2 菌株来源及分离培养 所分析菌株包括以上4份腹泻病人粪便标本在厌氧和CO2环境中分离的各50株左右屎肠球菌和个别粪肠球菌;4个健康儿童粪便标本厌氧和CO2环境中分离的各10株肠球菌。取0.01mL粪便悬液,均匀涂布整个血平皿。在厌氧和 5%CO2两种条件下,用厌氧血平皿置37℃温箱培养24h,接种肠球菌的选择性培养基(含七叶苷的脑心培养基础),每份标本逐个挑选50个黑色菌落左右。

1.3 主要试剂 AmpliTaq Gold DNA聚合酶购自ABI公司;dNTP购于Promega公司;Sma I酶和DNA分子量marker购自Takara公司;DNA回收试剂盒Qiaquick®Gel Extraction kit购自Qiagen公司的;细菌基因组DNA提取试剂盒购自Promega公司;触酶、氧化酶购自梅里埃公司;溶菌酶购自Invitrogen公司。

表1 4个腹泻儿童的病历材料Table 1 Medical record of 4 diarrhea children

1.4 主要仪器和设备 PCR仪为MG公司的PTC-200;凝胶成像系统为Bio-Rad公司Gel Doc XR型凝胶成像仪;细胞培养箱为Thermo forma;厌氧培养罐购自Oxoid公司;生化鉴定仪为DATE BEHRING公司Microscan WalkAway40 S1;PFGE为Bio-Rad公司 CHIF-Mappper脉冲场凝胶电泳仪。

1.5 16S rRNA基因序列分析方法

1.5.1 临床标本的采集和处理 无菌采集腹泻病人的粪便标本、称重,加10倍体积磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)重悬。4℃,12 000r/min离心 2min,弃上清。……