崔一喆,王 新,韩铁锁

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319)

金银花为常用传统中药,具有清热解毒、抗多种病原微生物、免疫增强、消除耐药质粒等多种功效[1]。而甲氧苄啶(TMP)作为合成抗菌药,本身抗菌作用较弱,一般不单独应用;临床上TMP主要用作磺胺类药物的抗菌增效剂,其还可以增强多种抗生素类药物以及中草药的抗菌作用[2-3]。但目前有关TMP对金银花的抗菌增效作用研究较少,尤其增效的剂量关系研究未见报道。本试验旨在通过研究金银花与TMP联用的性质和增效的剂量关系,从而确定TMP对金银花抗菌增效的最佳剂量,为中西药复方制剂的开发提供基本理论支持。

1 材料与方法

1.1 菌种 金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌分离株由黑龙江八一农垦大学预防兽医学教研室鉴定保存。

药物:甲氧苄啶购于太原市康瑞宝兽药制造有限公司,批号:20080503。金银花购于大庆福瑞邦医药有限公司,由黑龙江八一农垦大学中兽医教研室林春驿教授鉴定。

1.2 药物溶液的制备 精确称量128 mg的甲氧苄啶制成1 280 μ g/mL的甲氧苄啶药液100 mL。采用水提醇沉法制备含2 g/mL生药的金银花提取液100 mL。将药液流通蒸汽灭菌30 min,4℃冰箱保存备用。

1.3 菌种活化 采用常规方法进行细菌活化,将菌液稀释至浓度为 1×107CFU/mL,4℃冰箱保存备用。

1.4 金银花与TMP联用体外抗菌活性试验 采用微量棋盘稀释法进行试验。通过比浊法测定各药和药物联合时的MIC值,参照徐淑云报道[4]的方法进行FIC指数的计算和判定联合应用的性质。

1.5 金银花与TMP联用体外抗菌量效关系试验采用试管二倍稀释法及倾注平板计数法进行试验[5]。用无菌肉汤将金银花提取液稀释到2MIC浓度 ,将 TMP 稀 释 到 640 μ g/mL 、320 μ g/mL 、160 μ g/mL、80 μ g/mL 和 40 μ g/mL 浓度 。取 7 只已编号无菌试管,1～5号管分别加入已稀释的 4种TMP溶液1 mL和2 MIC的金银花药液1 mL,6号管中加入2 MIC的金银花药液和肉汤各1 mL,7号管为对照管加入肉汤2 mL;然后每个试管中加入2×106CFU/mL细菌悬液0.1 mL。充分摇匀后,4℃冰箱静置。分别在 1、2、4、8 h倾注平板进行菌落计数,计算杀菌率。其计算公式为:杀菌率=(对照管菌落数-试验管菌落数)/对照管菌落数×100%。试验重复3次。

1.6 数据处理 采用SPSS软件中ANOVA程序进行数据统计学分析。

2 结果

2.1 金银花与TMP联用体外抗菌活性试验 由表1可知,金银花与 TMP联用对3种细菌的MIC值均小于单独应用,经计算对大肠杆菌、沙门菌FIC指数均在0.5～1之间,呈现相加作用。

表1 金银花与TMP联合应用的抗菌效果

2.2 金银花与TMP联用体外抗菌量效关系试验

由表2可见,随着 TMP剂量的增加,金银花与TMP联用的抗金黄色葡萄球菌效果显著增强。利用最小二乘法对数据进行拟合,得到1、2、4 h和8 h杀菌率的回归方程与拟合度分别为y=-0.000 5x2+0.244 4x+32.629,R2=0.970 7;y=-0.000 5x2+0.247 7x+48.486,R2=0.981 3;y=-0.000 4x2+0.196 7x+65.441,R2=0.950 2;y=-0.000 4x2+0.179 3x+77.064,R2=0.988 5。从而得出最优值分别为 244 μ g · mL-1、248 μ g · mL-1、246 μ g ·mL-1和 224 μ g · mL-1,计算出 TMP 添加量的95%置信区间为 231 μ g ·mL-1～ 249 μ g ·mL-1。

表2 金银花与不同浓度TMP联用对金黄色葡萄球菌的杀菌率 (%)

由表3可知,随着TMP剂量的增加,金银花与TMP联用的抗大肠杆菌效果显著增强。利用最小二乘法对数据进行拟合,得到1、2、4 h和8 h杀菌率的回归方程与拟合度分别为y=-0.000 4x2+0.215 8x+32.301,R2=0.959 5;y=-0.000 4x2+0.192 6x+49.327,R2=0.973 6;y=-0.000 4x2+0.195 5x+59.158,R2=0.978 3;y=-0.000 4x2+0.190 0x+69.856,R2=0.979 8。从而得出 TMP最优值分别为 270 μ g ·mL-1、241 μ g ·mL-1、244 μ g·mL-1和 238 μ g· mL-1,计算出 TMP 添加量的 95%置 信 区间 为 237 μ g ·mL-1～259 μ g ·mL-1。

表3 金银花与不同浓度TMP联合应用对大肠杆菌的杀菌率 (%)

由表4可知,随着TMP剂量的增加,金银花与TMP联用的抗沙门菌效果显著增强。利用最小二乘法对数据进行拟合,得到1、2、4 h和 8 h杀菌率的回归方程与拟合度分别为 y=-0.000 5x2+0.229 5x+32.999,R2=0.963 4;y=-0.000 5x2+0.240 0x+40.522,R2=0.981 7;y=-0.000 4x2+0.200 9x+51.288,R2=0.971 7;y=-0.000 3x2+0.160 5x+65.417,R2=0.992 3。从而得出 TMP最优值分别为 230 μ g ·mL-1、240 μ g ·mL-1、251 μ g·mL-1和 268 μ g· mL-1,计算出 TMP 添加量的 95%置信区间为 235 μ g ·mL-1～ 259 μ g ·mL-1。

表4 金银花与不同浓度TMP联合应用对沙门菌的杀菌率 (%)

3 讨论

本试验采用了国内外常用的微量棋盘稀释法测定金银花与TMP联用的FIC指数,试验结果表明TMP对金银花发挥显著的增效作用。这与周可炎等报道[6]TMP对金银花有不同程度的抗菌增效作用相一致。金银花抗菌机理与抑制细菌生物膜(biofilm,BF)的形成有关,陈一强等[7]研究发现金银花水煎液在体外能抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,Pa)对固体表面的粘附能力及BF的形成能力,并能破坏Pa已形成的BF,增强抗生素头孢他啶对BF内铜绿假单胞菌的清除作用。TMP可抑制细菌核酸的合成,据此可推断金银花与TMP联用时可抑制细菌的生长繁殖的各个阶段而发挥抗菌作用。

FIC指数只能定性说明药物联用的性质,而TMP最佳添加剂量更具有临床应用价值。因此在参照王芙蓉的试验方法[8]基础上,为了避免 TMP发挥主要抗菌作用,选择了稍高于MIC值的 TMP最大添加量;采用了4℃冰箱静置的方式使药物作用于细菌,避免了恒温培养时细菌呈几何基数增殖造成的用药组与对照组之间的不可比性;再通过对杀菌率进行最小二乘法拟合,计算出 TMP增强金银花抗3种细菌的最优添加量的95%置信区间分别为 231 μ g · mL-1～ 249 μ g · mL-1、237 μ g ·mL-1～ 259 μ g · mL-1和 235 μ g ·mL-1～ 259 μ g·mL-1。徐永昭[9]经研究中发现TMP对金银花注射液有明显的抗菌增效作用,其注射液中加入5%TMP抗菌增效作用最强,故在临床上可以配制含5%TMP的增效金银花注射液。与本试验在定性研究中的TMP用量存在一定的差异,可能与试验方法和判定标准存在差异有关。

[1]王林青,崔保安,张红英.金银花药理作用研究进展[J].中国畜牧兽医,2007,34(11):91-95.

[2]Ana C Gales,Ronald N Jones,So raya S Andrade.Antimicrobial susceptibility patterns of unusual nonfermentative gramnegative bacilli isolated from Latin America:report from the SENT RY Antimicrobial Surveillance Program(1997～2002)[J].Mem Inst Oswaldo,2005,100(6):671-677.

[3]陈杖榴.兽医药理学[M].北京:中国农业出版社,2002:233.

[4]徐淑云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2001:1662-1663.

[5]马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京:科学出版社,2000:206-213.

[6]周可炎,曹迎春,谭超,等.TMP对中草药煎液的抗菌增效作用[J].湖南农业大学学报,1999,25(6):483-486.

[7]陈一强,覃雪军,朱莲娜.金银花水煎液及联合头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜的体外影响[J].中华微生物学及免疫学杂志,2004,24(9):738-742.

[8]王芙蓉.TOHT复方制剂的抗菌、抗病毒及对免疫增强效果的研究[D].长沙:湖南农业大学,2006:21-24.

[9]徐永昭.TMP对金银花注射液增效作用的研究[J].中成药,1993,15(7):7-9.