邱 杨,肖性龙,赵 丽,刘建丽,余以刚,吴 晖

(1.东莞出入境检验检疫局,广东 东莞 523072; 2.华南理工大学轻工与食品学院,广东 广州 510640;3.深圳太太基因工程有限公司,广东 深圳 518057)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,对偶蹄兽有重大危害。口蹄疫病毒共有7个血清型,各个血清型的病毒之间不能产生交叉免疫。因此,口蹄疫病毒快速准确的分型是口蹄疫诊断的重要内容,可为疫苗的选择和流行病学研究提供有价值的信息。目前我国主要受周边国家和地区O、AsiaⅠ、A三种血清型病毒的威胁,本试验建立了多重荧光 RTPCR方法用于区分上述3种血清型FMDV。相比于常规的诊断方法,PCR检测具有准确直接的优点,对于口蹄疫病毒的快速定型具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 毒株 口蹄疫病毒O、A型和AsiaⅠ型标准抗原购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等动物病毒均由深圳出入境检验检疫局的实验室分离、保存。

1.2 设备和试剂 ABI7500实时荧光PCR仪;Genequant Pro型核酸蛋白分析仪;TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、TaKa-Ra One Step RNA PCR Kit均为宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.3 引物和探针的设计与合成 根据基因库中登录的O型 、A型和AsiaⅠ型序列筛选出各病毒的保守区段,分别设计 3对特异PCR引物和 Taq Man探针。将发射波长相差较大的荧光染料基团,分别标记O型、A型和AsiaⅠ型的 Taq Man探针5′端。上述引物和Taq Man探针均由上海基康生物技术有限公司合成、标记,具体序列和探针标记见表1。

表1 O型 、A型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒引物和探针序列

1.4 多重荧光RT-PCR的检测方法的建立和条件优化 在T aKaRa一步法RT-PCR基础上,对O型、A型 和AsiaⅠ型多重荧光RT-PCR反应体系中引物和Taq Man探针浓度进行筛选,对PCR反应条件、PCR的各循环参数进行优化,以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值(△Rn)。

1.5 多重荧光RT-PCR的特异性试验 取O型、A型和AsiaⅠ型以及其他7株常见动物RNA病毒细胞培养液,分别提取核酸作为模板进行多重荧光RT-PCR检测,观察结果确定其特异性。

1.6 多重荧光 RT-PCR的灵敏度检测 提取O型、A型和AsiaⅠ型病毒液的总RNA,分别进行10倍系列稀释(10-1～10-5),以每个稀释度的核酸作为模板进行多重荧光RT-PCR检测,观察其最低的检测限。

1.7 多重荧光RT-PCR的干扰性试验 将O型、A型和AsiaⅠ型标准样品不同的模板浓度进行组合,进行多重荧光RT-PCR检测,确定浓度相差较大时各标准样品之间的检测是否存在相互干扰现象。

1.8 多重荧光RT-PCR临床试验 利用所建立的多重实时荧光RT-PCR对送检的10批283份样品进行临床检测,并与ELISA和病毒分离鉴定结果进行比较。

2 结果与分析

2.1 多重荧光RT-PCR的条件优化 结果表明,O型、A型和AsiaⅠ型各引物和探针采用以下浓度扩增效果最好:400 nmol/L O型-F,400 nmol/L O型-R,200 nmol/L O型-P,400 nmol/L A型-F,400 nmol/L A型-R,200 nmol/L A型-P,400 nmol/L AsiaⅠ型-F,400 nmol/L AsiaⅠ型-R和200 nmol/L AsiaⅠ型-P。优化后的反应程序如下:42℃30 min反转录;94℃4 min终止反转录;94℃15 s,55℃1 min,重复40个循环。

2.2 多重荧光RT-PCR方法的特异性 用所建立的多重荧光RT-PCR对其他7株常见动物RNA病毒进行检测,结果呈阴性反应。试验数据表明所设计的引物探针,只对目的病毒特异,与其他检测对象无交叉反应。

同时加入O型、A型和AsiaⅠ型的口蹄疫病毒RNA于一管中进行三联模板的检测,结果表明3种血清型口蹄疫病毒分别得到相应的特异性扩增曲线(见图1)。此外,利用该方法对单一模板和二联模板进行检测。分别只加入O型、A型和AsiaⅠ型其中一种病毒RNA进行单一检测,结果表明3种血清型的口蹄疫病毒均得到相应的特异性扩增曲线;分别将 O型、A型和 AsiaⅠ型其中两种病毒RNA加入一管进行二联检测,结果表明,该方法至少可同时检测出两种血清型的口蹄疫病毒。

图1 多重荧光RT-PCR同时检测O型、A型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒

2.3 多重荧光RT-PCR的检测灵敏度 结果多重荧光RT-PCR可以单独检测的O型最低稀释度为10-3,达到2.68 pg/μ L浓度的病毒RNA。用同样试验方法证实多重荧光RT-PCR对A型、AsiaⅠ型单检的分析敏感度分别为10.52 pg/μ L和30.56 pg/μ L(图 2 、3、4)。

2.4 荧光RT-PCR重复性试验 试验结果如表2所示,当其中一病毒RNA模版浓度较高而另一个病毒RNA模板浓度较低时,所建立的方法依然可以同时检测到各个目的病毒。

图4 AsiaⅠ型单检灵敏试验

2.5 多重实时荧光RT-PCR临床试验 利用所建立的多重实时荧光RT-PCR对送检的10批283份样品进行检测,结果检测到O型阳性5份、A型阳性2份、AsiaⅠ型3份,其中有1份为 O型和亚 A-siaⅠ型的混合感染。所检测结果与口蹄疫单重荧光RT-PCR分型方法和病毒分离鉴定、ELISA检测结果符合率为100%。

3 讨论

本研究主要在同一反应管内进行3个亚型的扩增检测反应,同时收集代表3个不同亚型的荧光信号,对扩增产物进行实时在线检测,从而建立了能够同时检测口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ三种亚型的多重实时荧光RT-PCR方法。实验室阶段的试验和田间试验均证实,该方法是一种快速、简便、高效的检测平台。

临床出现混合感染时,两种或多种病原的含量相差较大[1-2]。为了与实际情况相符,将口蹄疫O、A、AsiaⅠ三种亚型的模板浓度进行调整、组合,从而探讨高浓度模板对低浓度模板是否存在干扰现象。结果发现,在3个模板浓度相差较大时,仍可以进行三重检测,一个或两个较高浓度亚型的模板对低浓度亚型的扩增检测影响不大。即使存在有混合感染,其中一种亚型是以潜伏感染的形式存在,病毒量很低,本方法也可准确检测区分出来。

目前,国内外检测口蹄疫的RT-PCR方法主要分为两种[3],一种是口蹄疫通用型检测方法。这种方法不能区分口蹄疫病毒的亚型,不能准确了解疫病的流行动态;另一种是用不同的试剂盒区分口蹄疫病毒各个亚型的单重检测方法,操作繁琐,费时费力。多重实时荧光 RT-PCR可同时进行口蹄疫3种亚型的检测,大大缩短检测周期。

[1]Cooke J N,Westover K M.Serotype-specific differences in antigenic regions of foot-and-mouth disease virus(FMDV):A comprehensive statistical analysis[J].Infect Genet Evol,2008,8(6):855-863.

[2]Tong LIN,Jun-zheng DU,Jun-jun SHAO,et al.Application of VP1 Protein to Develop Monoclonal Antibody against Footand-mouth Disease Virus AsiaⅠType[J].Virologica Sinica,2009,24(3):215-220.

[3]张亮,卫广森.口蹄疫诊断技术的研究进展[J].中国兽药杂志,2009(4):20.