邱河辉,赵 娟,刘凤华,朱晓宇,甘静宜,王霞泰,许剑琴

(1.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;2.北京农学院动物科技系,北京昌平102206;3.农业部兽用化药和中草药创制与评价重点开放实验室,北京海淀100193)

随着养犬数量的快速增加,病毒性疾病严重威胁犬的健康。犬瘟热病毒、犬细小病病毒等诱导非炎性淋巴细胞程序性衰竭,侵入并破坏机体免疫系统[1]。脾脏是机体外周免疫应答的重要场所,抗原一旦进入即可诱导 T细胞和 B细胞的活化与增殖[2]。因此,开发能增强犬抵抗病毒性疾病、增强脾脏免疫细胞功能的中兽药很有研究意义。研究表明,黄芪多糖(APS)对机体非特异性免疫与特异性免疫有广泛的影响,可促进T淋巴细胞转化和增强B淋巴细胞活性[3],促进 IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的分泌[4]。目前,APS对犬脾淋巴细胞细胞因子mRNA表达的研究鲜见报道,对犬免疫平衡的调节还有待深入研究。本研究用APS与ConA或LPS协同刺激犬脾淋巴细胞,观测相关细胞因子mRNA的表达,探讨APS对犬细胞免疫功能的影响,为其临床应用和保健品的开发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 APS(批号:HD006001,北京美迪克斯生物科技有限公司),RPMI-1640培养基(批号:NSG0059,海克隆生物化学制品有限公司),Hank's Balanced Salt(批号:ASD29233,海克隆生物化学制品有限公司),淋巴细胞分离液(批号:080712,灏洋生物公司),Trizol Reagent(批号:1401902,Invitrogen),LPS(批号:L2880,Sigma),ConA(批号:C2631,Sigma),HEPES(批号:0511,Amresco)。

1.2 犬脾淋巴细胞的采集 5月龄中华田园犬麻醉后放血致死,常规方法制备脾淋巴细胞[5]。细胞悬浮于RPMI-1640完全培养液(含10%胎牛血清,100 IU/mL 青霉素 、100 μ g/mL 链霉素 ,12 mmol/L HEPES(pH 7.1),0.05 mmol/L 2-巯基乙醇)。细胞悬液用0.3%台盼蓝染色,显微镜下计数活细胞数大于95%,最后调整细胞浓度为2×106cells/mL。1.3 犬脾淋巴细胞培养 按参考文献报道方法[6],对照组(CG)只加 1 mL完全培养基;ConA组加0.05 μ g/μ L ConA 300 μ L;LPS 组加 0.1 μ g/μ L LPS 300 μ L;APS 组 加 0.1 μ g/μ L APS 300 μ L;APS+ConA 组加 0.1 μ g/μ L APS 300 μ L 和 0.05 μ g/μ L ConA 300μ L;APS+LPS 组加 0.1 μ g/μ L APS 300 μ L 和 0.1 μ g/μ L LPS 300 μ L,各组加入2 mL细胞悬液,最后完全培养基补充至3 mL。每组6个重复,37℃、5%CO2培养箱中孵育48 h。

1.4 犬脾淋巴细胞细胞因子mRNA表达

1.4.1 总RNA提取 细胞悬液吸至离心管中,1 500 r/min(4℃)离心 10 min,冷 PBS洗涤 1次。沉淀中加T rizol Reagent 1.0 mL,常规方法提取细胞总RNA,20 μ L DEPC水溶解。

1.4.2 引物设计 参照GenBank网站公布的犬相关基因序列的CDs保守区,用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件设计相关基因引物,其引物序列和扩增产物为β-actin上游GGAACGCAAGTAT TC TGTG,下游 TCCCAACCCTGT TAGACC;IL-2 上游 ATCGCACTGACGCT TGTA,下游 AAACCT AGCACT TCCTCC;IL-12上游TTAGCAGCATC TATGAGGA,下游CAAGGGAGGATT TCTGTG;IFN-γ上游 GATGTATCGGACGGTGGG,下游GT TCATT TATCGCCT TGC;TNF-α上游CAGCCTCTTCTCCTTCCTC,下游 ACCCATCTGACGGCAC TA;IL-4上游 GCACTCACCAGCACCTTT,下游GCCGCAGTACAGTAGCAG

1.4.3 cDNA的合成及PCR扩增 cDNA合成及PCR反应:反转录cDNA后进行PCR扩增,扩增反应程序为:94℃5 min,94℃40 s,56.6℃(β-actin)、57.2℃(IL-2)、57.4℃(IL-12)、56.4℃(IFN-γ)、56.6℃(TNF-α)、57.6℃(IL-4)、40 s,72 ℃50 s,30个循环后,72℃自动延伸10 min,4℃结束反应。

1.4.4 RT-PCR产物灰度分析及数据处理 凝胶成像和分析系统以目的基因IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ、TNF-α增量与内对照β-actin扩增量比值分别表示它们的mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 APS协同ConA或 LPS刺激犬脾淋巴细胞Th1细胞因子mRNA表达 图1显示,与CG相比,APS可显著(P＜0.05)提高 IL-2、IFN-γ和TFN-αmRNA的表达;ConA促进IFN-γ和TNF-α mRNA的表达(P＜0.05);APS+ConA显著(P＜0.05)促进IFN-γ、TNF-α和降低 IL-2 mRNA 的表达;LPS显著(P＜0.05)降低Th1型细胞因子mRNA的表达;APS+LPS显著(P＜0.05)降低IL-2、IL-12和TNF-αmRNA的表达。与ConA组比较,APS显著(P＜0.05)提高IL-2和IFN-γmRNA的表达;APS+ConA显著(P＜0.05)促进IL-12、IFN-γ和TNF-αmRNA的表达。与LPS组比较,APS显著(P ＜0.05)促进 IL-2、IL-12、IFN-γ和TFN-αmRNA的表达;APS+LPS显著(P＜0.05)提高IFN-γ和 TNF-αmRNA的表达。

2.2 APS协同ConA或LPS刺激犬脾淋巴细胞IL-4 mRNA表达 图 2表明,与 CG比较,IL-4 mRNA的表达ConA组和APS+ConA组显著增加(P＜0.05),而LPS组和APS+LPS组显著降低(P＜0.05)。与ConA组比较,APS+ConA组未见明显变化。与 LPS组比较,APS组和APS+LPS组均显著增加(P＜0.05),前者更加显著。

3 分析与讨论

CD4+T细胞可分为 Th1和 Th2两个细胞亚群。Th1 细胞主要分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-12等细胞因子,主要介导细胞免疫应答;Th2细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13等细胞因子,主要介导体液免疫应答[7]。

本研究中以IL-2 、IL-12、IFN-γ和 TNF-α mRNA的表达代表Th1型细胞因子的表达。图1结果表明,APS对犬脾淋巴细胞 IL-2、IFN-γ和 TNF-α mRNA表达有显著增强作用,促进 IL-2和IFN-γ mRNA表达的效果显著优于ConA,对IFN-γ和TNF-αmRNA的表达与ConA表现出明显的协同作用。这与前人报道的 APS能促进脾淋巴细胞Th1型细胞因子mRNA表达的结果一致[4]。LPS对4种细胞因子mRNA表达具有显著抑制作用,APS能使它们的表达提高,表明APS具有介导细胞免疫应答的良好效果。

图1 淋巴细胞Th1细胞因子mRNA的表达

值得注意的是,APS协同ConA促进Th1类IFN-γ和TNF-αmRNA的表达的同时,IL-2 mRNA的表达相对较低。陈国友等人[8]报道,淋巴细胞功能相关分子(LFA-1)能抑制诱导的脾淋巴细胞增殖,并抑制IL-2的分泌,而LFA-1仅作用于丝裂原活化脾淋巴细胞的早期。由此可见,试验中IL-2 mRNA表达量的下降可能是APS协同ConA主要作用犬脾淋巴细胞活化的早期有关。

由图2分析可见,APS对犬脾淋巴细胞IL-4 mRNA表达没有明显影响;ConA及其与APS协同均可显著增加其表达,但是两者之间未见显著差异,表明APS与ConA的协同作用不明显。LPS对IL-4 mRNA表达呈现显著抑制作用;APS及其与LPS协同能使其表达显著高于LPS。说明IL-4 mRNA表达抑制时,APS能使其表达得到显著提高,发挥其免疫调节作用。

图2 淋巴细胞IL-4 mRNA的表达

正常状态下 Th1/Th2两类细胞因子处于平衡状态,以维持正常的免疫功能。有研究表明,当 T细胞在体外被激活时,Th1参与的反应常发生在早期,Th2细胞则随着免疫应答的进展而增多[9],当Th1类细胞占优势时,促进细胞免疫。本试验结果说明,APS能促进犬脾淋巴细胞Th1型细胞因子的表达,APS与ConA有很好的协同性,APS能调节LPS对犬脾淋巴细胞的抑制作用。

4 结语

APS对犬脾淋巴细胞 IL-2、IFN-γ和 TNF-α mRNA表达有显著增强作用,对IL-4 mRNA表达没有明显影响,当上述相关细胞因子mRNA表达抑制时,APS能使其表达得到显著提高。

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