侯玉杰,时成龙,相文华,郭 巍,李红梅,赵立平,胡 兰

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110161;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江哈尔滨150001)

马病毒性动脉炎(equine virus arteritis,EVA)是一种由马动脉炎病毒(EAV)引起的,在马属动物之间通过呼吸道或生殖器官传播的传染病。国际病毒分类委员会(International Committee on the Taxonomy of Viruses,ICTV)于2006年第八次分类报告[1]将EAV归属于套式病毒目动脉炎病毒科的成员,与乳酸脱氢酶增高症病毒(lactic dehydrogenase virus,LDV)、猪呼吸与繁殖综合征病毒(porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)、猿出血热病毒(simian hemorrhagic fever virus,SHFV)同科。EAV是线性单股正链RNA病毒,含有7个开放阅读框,编码4种结构蛋白:大囊膜蛋白GP5、囊膜蛋白M 、核衣壳蛋白N和小囊膜蛋白Gs。其中GP5蛋白是马动脉炎病毒最主要的保护性抗原[2],其55-98位氨基酸区域具有较强的免疫原性[3]。

世界许多国家的马群中均有本病存在[4],我国也存在此病,但还未分离到病毒。典型病例多为下列不同症状的不同组合:发热、精神沉郁、食欲减退、坠积性水肿、结膜炎及孕马流产等为特征,对马产业能引起严重的经济损失,在世界各国的马匹进出口检疫中十分重视。OIE将此病列为二类传染病,是马匹的重大必检疫病。本试验克隆EAV GP5蛋白主要抗原域编码基因并进行原核表达及纯化,并对重组的pGP5的免疫学活性进行了研究,为制备抗EAV单克隆抗体奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞及载体 EVA标准Bucyrus株、E.coli宿主菌DH5α和BL21(DE3)菌株、原核表达载体pET-30a质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。

1.2 工具酶主要试剂 病毒RNA提取试剂盒购自上海华舜公司,核酸回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Omega。工具酶购自宝生物工程(大连)有限公司。MEM培养基和小牛血清购自Gibco公司。FITC标记山羊抗兔IgG购自中衫金桥公司。His-Tag Monoclonal Antibody、BCA Protein Assay Kit为Novagen公司产品。Anti-Mouse IgG 、Anti-Rabbit IgG、OPD(邻苯二胺)、IPTG均购自Sigma公司。

1.3 引物设计 参照GenBank登陆的 EAV Bucyrus(NC-002532.2)基因序列,应用 DNAStar软件分析GP5蛋白抗原性,设计一对引物,目标扩增基因为EAV GP5蛋白主要抗原域编码基因,对应EAV GP5 79～330 bp。

GF:5′-GGA TCC CGC T TC ACA GAC T TC ACC-3′(BamH Ⅰ);

GR:5′-AAG CT T CTA AAA AGG GGG CAT GTC ATC-3′(Hind Ⅲ)

1.4 病毒增殖 将保存的EAV Bucyrus株接种单层RK-13,吸附50 min,2%血清MEM维持液37℃,5%CO2条件下培养。48 h后,当出现75%以上细胞病变(CPE)收毒,-80℃保存。

1.5 EAV GP5蛋白主要抗原域编码基因的扩增及表达载体pET-GP5的构建 取250 μ L病毒悬液,按华舜 RNA抽提试剂盒操作提取总 RNA。Oligo DT(18)1 μ L 与病毒总 RNA 8 μ L,70℃反应5 min,冰浴条件下加入预先配好的反转录体系,37℃、1 h,70℃、15 min后结束反应,总体系为 18 μ L。取5 μ L反转录产物为 PCR模板,按常规体系进行PCR,退火温度58℃,时间30 s,30个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将PCR胶回收产物与pET-30a质粒分别用BamHⅠ和HindⅢ双酶切回收目的片段。16℃连接过夜,转化至DH5α,按常规转化方法转化连接产物,37℃培养12 h,LB平板(50 μ g/mL Kan)挑单菌落,接种于 LB 培养基(50 μ g/mL Kan),37℃震荡培养12 h,保存菌种,提取质粒用BamHⅠ和 HindⅢ双酶切鉴定为阳性后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。选取测序结果完全一致的阳性质粒并命名为 pET-GP5,用氯化钙法制备 BL21(DE3)感受态细胞[5],按常规方法转化。

1.6 阳性转化菌的诱导表达条件的优化和表达产物的Western blot鉴定 将阳性转化菌接种于LB培养基(50 μ g/mL Kan)中37℃震荡过夜培养。次日以1%的量接种于5 mL LB培养基(50 μ g/mL Kan)37℃震荡培养至OD600约为0.6时分别加入1.0、0.8、0.6 、0.4、0.2 mmol/L 的 IPTG 进行诱导培养,并在 2h、4h、6h、8h和过夜分别取样进行 SDSPAGE分析。

将经诱导表达的菌液超声波处理后进行SDSPAGE,按常规方法进行转膜及反应,首抗为His-Tag Monoclonal Antibody,二抗为 Anti-Mouse IgG。用Western blot超敏发光液显色。

1.7 重组蛋白的纯化及复性 将阳性转化菌接种于 50 mL LB 培养基(50 μ g/mL Kan)中培养,适当OD值时诱导表达,6 h后收获菌体细胞,用5 mL 1×PBS重悬,超声波处理细胞重悬液至清亮,4 000 r/min(4℃)离心10 min,分别收获沉淀和上清液,SDS-PAGE电泳检测表达蛋白以包涵体形式存在。切胶纯化表达蛋白并进行透析复性[6]。

1.8 重组蛋白的抗原性鉴定

1.8.1 重组蛋白反应原性的鉴定 用纯化后的EAV按常规方法免疫家兔(免疫间隔15 d)进行多克隆抗体的制备,二免7 d后耳缘静脉采血,间接ELISA测其效价不低于10 000时心脏采血,收集血清。用制备好的兔抗EAV血清为首抗,Anti-Rabbit IgG为二抗,进行免疫印迹(Western blot),以鉴定pGP5反应性。

1.8.2 重组蛋白免疫原性的鉴定 用纯化后的pGP5按常规方法免疫家兔制备多克隆抗体。获得血清后进行间接免疫荧光试验,以兔抗pGP5免疫血清为首抗,羊抗兔FITC荧光抗体为二抗。

2 结果

2.1 目标扩增基因序列的同源性和编码蛋白的抗原性分析 应用软件DNAStar对EAV GP5蛋白进行抗原性分析,GP5蛋白55-98aa区域具有较强的免疫原性,设计合成一对引物扩增包括其编码基因,作为目标表达蛋白。

2.2 目的基因的扩增及重组质粒的鉴定 提取EAV病毒总RNA,应用设计的引物PCR扩增出大小为252bp的片段。测序结果表明扩增片段为目的基因。挑取表达载体转化菌落,振荡培养后提取质粒,应用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,电泳结果表明目的片段已成功插入表达载体。

2.3 阳性转化菌的诱导表达条件的优化、纯化及复性 不同时间和不同浓度IPTG诱导表达产物的SDS-PAGE 结果,0.2 、0.4 、0,6、0.8 mmol/L 及1.0 mmol/L 的IPTG 和2、4、6 h及 8 h(图1)均可有效诱导目的蛋白的表达,结果表明,不同IPTG浓度对蛋白表达的产量影响不大,但是诱导表达的时间越长蛋白表达的量就越大。根据试验需要选取0.2 mmol/L的IPTG,4 h为最佳诱导反应条件。表达产物的大小约为17 kDa,与预期理论值得蛋白分子量相符,占总菌体蛋白含量约为36%。在最佳条件下进行大量诱导,超声破碎后收集上清及沉淀,SDS-PAGE表明重组蛋白以包涵体形式出现(图2)。切胶纯化并复性。

2.4 表达产物的抗原性鉴定

2.4.1 Western印迹 Western blot的结果表明,纯化复性后的pGP5与兔抗EAV pGP5阳性血清反应,在17 kDa处出现1条特异性的条带(图3),表明pGP5有良好的反应原性。

图3 兔抗EAV高免血清的Western blot

2.4.2 间接免疫荧光试验 间接免疫荧光试验结果显示,制备的兔抗pGP5免疫血清能特异性地与接种EAV 24 h后的RK-13细胞发生反应,荧光显微镜下可见细胞内出现特异性荧光,而对照胞浆内没有特异性荧光(图4),说明pGP5具有较好的免疫原性。

图4 间接免疫荧光的检测(400×)

3 讨论

马病毒性动脉炎主要引起马呼吸与繁殖系统障碍,严重影响赛马质量。国际上也规定,凡是微量中和试验血清1∶4结果为阳性的马匹不准进出口[7]。2008年奥运会以后,随着中国赛马业日渐鼎沸,EVA检出率也随之上升。可能是由于2008年奥运会后,赛马业快速发展,而EAV防治相对滞后的结果。EAV具有高度接触传染性,呼吸道吸入、交配和人工授精是主要传播途径。应加强对引进种马精液及马厩卫生的管理,以减少传染源。我国对EAV的研究较少,梁成珠等(1996年)曾应用中和试验在国内进行过进出境马匹的抗体检疫和监测,黄从平、路承平等(2000年)利用EAV的血凝特性检测出入境马血清样本均检出过EAV抗体阳性马,但是未分离到病毒。所以在实际工作中,需要一种能准确检测EAV抗体的方法,这对检疫检测人员提高工作效率具有重要的现实意义。

研究证实,病毒蛋白质GP5可刺激机体引起体液免疫反应,这便导致产生了应用细菌或杆状病毒表达系统制备部分或整个重组蛋白作为包被抗原可检测 EAV抗体[8-10]。本研究应用 DNAStar对EAV GP5蛋白进行抗原性分析,运用RT-PCR技术从EAV Bucyrus株基因组中克隆了 EAV GP5蛋白的主要抗原域编码基因,并成功的进行了GP5蛋白的高效表达及纯化,免疫印迹及间接免疫荧光试验表明,表达产物具有良好的免疫原性。为准确检测EVA及相关产品的开发提供有利的条件。

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