纪 瑛

（甘肃农业职业技术学院，甘肃兰州 730020）

苦参（Sophora flavescensAit）为豆科槐属植物，是我国传统药用植物［1］。分布于河北，河南，陕西，甘肃，辽宁一带的浅山区与坡地。苦参有清热利湿，祛风杀虫之功效，现广泛应用于治疗急性细菌性痢疾，顽固性湿疹等疾病［2］，近年又用于治疗非典和肿瘤［3］，尤其是天然绿色动植物杀虫剂的开发使用［4，5］，使其用途越来越广，随着其用途的不断研究与开发，其用量呈逐年递增之势。长期以来一直是以采挖野生资源提供药源。由于过度采挖，使野生资源日渐耗竭，难以维持快速发展工业生产的药源。现行药典以氧化苦参碱和苦参碱含量及其他常规鉴别项目作为控制苦参质量的手段和指标［6］，但单一成分并不能全面地反映药材质量。近年来，已有苦参指纹图谱的研究报道［7］，这些研究主要对野生苦参的指纹图谱建立的方法与评价做了研究。对于栽培苦参的化学成分指纹图谱以及与野生苦参的对比研究还未见报道，本文采用HLPC方法，对不同产地野生、人工栽培的苦参药材进行分析，建立化学成分指纹图谱，对苦参样品的指纹图谱进行评价比较，比较不同产地的苦参和人工栽培的苦参化学指纹图谱，为苦参的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1仪器与试剂

Ultimate 3000戴安高效液相色谱仪（美国戴安公司），二极管阵列检测器（DAD），色谱柱C18（150 mm×6.4 mm），手动进样器，电子分析天平，Anke TDL-40B离心机，隔膜真空泵及溶剂过滤器。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为重蒸馏水。苦参对照药材（121019-200304），氧化苦参碱标准品（110780-200405）购自中国药品生物制品检定所。

1.2 样品及预处理

收集河北承德、河南卢氏、甘肃成县的3份苦参野生药材，甘肃岷县的5份苦参栽培品材料，甘肃酒泉的5份苦参栽培品材，甘肃榆中的6份苦参栽培品材料。实验用苦参野生药材和栽培药材经甘肃农业大学药用植物系蔺海明研究员鉴定均为豆科槐属植物苦参（Sophora flavescensAit）的根。所有样品见表1。将各干燥的苦参样品粉碎，置于干燥器中保存，备用。

表1 20批苦参药材样品来源

2 数据处理

SPSS（13.0）统计分析软件;国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004版）软件。

3 结果与分析

3.1 色谱条件的优化确定

苦参药材主要有效成分为苦参类生物碱，综合考虑所要检测的苦参生物碱类化合物的极性，同时为确保所有成分能在一个色谱条件下均被洗脱，流动相A选用乙腈，流动相B选用水的二元体系对苦参样品进行梯度洗脱，梯度程序以100%乙腈结束［8］。本实验优化后的梯度洗脱程序见表2，流速0.5 mL/min。二极管阵列检测器（DAD），比较200 nm，

220 nm，235 nm，245 nm和255 nm 5个检测波长下的色谱峰，选择波长235 nm为检测波长。

表2 苦参药材梯度洗脱程序

在上述优化色谱条件下，色谱峰的分离度好，色谱峰在0～60 min内分布，氧化苦参碱对照品和苦参对照药材色谱图见图1和图2。图2与图1比较可知，在相同色谱条件下，氧化苦参碱的保留时间与苦参对照药材色谱图中的3号峰一致。因此，推测对照药材色谱图中的3号峰为氧化苦参碱。

图1 氧化苦参碱对照品HPLC色谱图

图2 对照药材HPLC指纹色谱图

3.2 提取条件的优化选择

以苦参药材为样品，选择不同提取方法，不同溶剂进行比较试验。回流提取用50%甲醇和85%乙醇作溶剂，回流时间1 h，超声提取用50%甲醇、85%乙醇、氯仿作溶剂，用以上5种方法制备的供试品溶液，分别在上述优化色谱条件下进样，记录色谱图，根据色谱图综合评价提取效果，结果发现50%甲醇回流1 h的色谱图出峰多，因此采用50%甲醇回流1 h提取方法为本实验的最佳提取方法。

3.3 精密度

取一份苦参样品（5号样）的供试溶液，在上述色谱条件下，重复进样5次，记录指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间RSD为0.3% ～2.08%，峰面积比值的RSD为1.05%～3.69%，符合指纹图谱的检测要求。

3.4 稳定性

取一份苦参样品（5号样）的供试溶液，在上述色谱条件下，分别在0，2，4，8，24 h 进样测定，记录指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间RSD为0.3% ～2.87%，峰面积比值的RSD为1.15% ～4.66%，表明供试液在15 h内基本稳定。

3.5 重复性

取苦参样品（5号样）5份，分别精密称定，按供试品溶液制备方法平行制备供试液，在上述色谱条件下，分别进样记录指纹图谱。计算各共有峰的相对保留时间RSD为0.09% ～3.32%，峰面积比值的RSD为0.44% ～4.58%，符合指纹图谱的检测要求。

3.6 指纹图谱建立与分析

按上述液相色谱条件测定了氧化苦参碱对照品、1个苦参对照药材、19个不同产地野生和人工栽培的苦参样品。采用相对保留时间确认指纹峰。色谱图中以氧化苦参碱作为参比峰，相对保留时间即各指纹峰保留时间与同一图谱中氧化苦参碱峰保留时间的比值。指纹峰峰相对峰面积即各指纹峰面积与同一图谱中氧化苦参碱峰面积的比值。结果显示，人工栽培苦参图谱峰的数量普遍较对照药材和野生药材图谱少，有些峰缺失。根据各样品图谱中色谱峰的相对保留时间，以氧化苦参碱对照品和对照药材指纹图谱作为参照谱，选择了其中15个色谱峰作为指纹图谱的特征峰（图2，3，4），3号峰为氧化苦参碱，各共有峰相对保留时间RSD小于5%（表3）。计算共有峰的相对峰面积，建立苦参的指纹图谱（表4）。对15个共有峰相对保留时间进行聚类分析，结果见图5，15个共有峰可分为5个峰群，1号峰和2号峰归为第1 个峰群，3，4，5，6，7 号峰归为第 2 个峰群，8，9，10 号峰归为第3个峰群，11号峰为第4个峰群，12，13，14，15号峰归为第5个峰群。

图3 野生药材HPLC指纹色谱图

图4 栽培药材HPLC指纹色谱图

表3 20批样品共有峰相对保留时间

表4 20批样品共有峰峰面积比值

3.7 指纹图谱相似度评价

对1个苦参对照药材、19个不同产地野生和人工栽培的苦参样品的HPLC指纹图谱共有峰进行相似度计算，以相关系数表征相似度，结果见表5，从中可以看出，19个苦参样品指纹图谱共有峰与对照药材（1号样）相似度为0.96～0.99，其中甘肃成县产野生苦参（7号样）和河北承德产野生苦参（8号样）与对照药材的相似度最高，而栽培苦参与对照药材的相似度相对较低。19个苦参样品之间相似度为0.93～0.99，岷县栽培1年生苦参（2号样）与其他各样品之间相似度最低，可能是栽培年限低的原因。结果表明，栽培苦参和野生苦参存在差异，但是20个样品指纹图谱的相似度大于0.93，说明建立的苦参样品指纹图谱相似度较高，具有一定的代表性。

表5 20批样品指纹图谱相似度分析

图5 苦参20个样品共有峰聚类分析结果

4 讨论与结论

本实验通过比较不同的样品制备方法，考察不同的色谱条件，检测波长，建立了人工栽培苦参和野生苦参药材HPLC化学成分指纹图谱的检测方法（未知谱峰，有待进一步标定），为苦参药材的全面质量控制研究提供参考。

HPLC指纹图谱分析与相似度评价结果表明苦参人工栽培药材、野生药材与对照药材化学指纹图谱存在15个共有峰，分成5个峰群。经相似度计算，19个苦参样品之间相似度为0.93～0.99。但是人工栽培药材与野生药材之间存在一定差异明显，表现栽培年限越低相似度越小，推测造成两者存在明显差异的主要原因是人工栽培药材的生长年限较野生的低，而且受栽培措施的影响，可能使其化学成分或许发生一些变化。

根据以上结果，建议苦参在人工栽培过程中注意栽培措施和载培年限对化学成分的影响。

［1］楼之岑，秦 波.常用中药材品种整理和质量研究［M］.北京:北京大学医学出版社，1995:343-376.

［2］苗抗立.苦参的化学成分及药理研究进展［J］.天然产物的研究与开发，2001，13（4）:8-11.

［3］郑艳敏，李 轩，赵红艳，等.苦参碱和氧化苦参碱对SMMC-7721细胞增殖及Stat3，Stat5基因表达的影响［J］.中国中药杂志，2008，33（19）:2234-2237.

［4］王俊梅，豆 卫，杨自芳，等.苦参碱对草地蝗虫种群密度的控制效果［J］. 草原与草坪，2008，（6）:66-68.

［5］张淑红，周宝利，张 磊，等.土壤添加蛇床子（Cnidium monnieri）和苦参（Sophora flavescens）对茄子黄萎病及根际微生物的化感影响［J］.生态学报，2008，28（10）:5194-5199.

［6］中国药典［S］.一部.2005:141.

［7］徐今宁，蒋贵昱，汤建华.苦参药材高效液相指纹图谱分析方法研究［J］.河北北方学院医学版，2008，25（2）:15-18.

［8］周玉新.中药指纹图谱研究技术［M］.北京:化学工业出版社，2002.