王欣东 陈淅泠 李秋霞 张晓峰

郑州大学第二附属医院 郑州 450014

血管性痴呆是由不同脑血管病变所致，以学习记忆障碍为主要临床表现的慢性获得性严重认知功能障碍综合征，为脑血管疾病常见后遗症之一，给患者家庭带来很大困扰。丁苯肽是我国开发的抗脑缺血新药，可从多个环节起到抗脑缺血作用。丁苯肽对血管性痴呆学习记忆障碍是否有治疗作用，目前报道不多。我们拟采用血管性痴呆大鼠动物模型，探讨丁苯肽在血管性痴呆中的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂与器材 健康雄性Wister大鼠42只，体质量（400±20）g（郑州大学实验动物中心购买），丁苯肽（石药集团恩必普药业有限公司提供），MG－2－Y型迷宫（张家港市生物医学仪器厂），P38 MAPK特异性抗体（北京博奥森公司，兔源，对大鼠P38MAPK特异），iNOS特异性抗体（美国Santa Cruz公司，兔源，对鼠iNOS特异），SP9000试剂盒（北京中杉生物工程公司），TUNEL试剂盒及DAB显色剂（北京博奥森公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物的分组、模型制作及给药方法：大鼠在试验动物房适应性饲养1周后，随机把42只大鼠分到假手术组，模型组，丁苯肽组。3组大鼠均用10％水合氯醛（3.5 mg/kg）腹腔内注射麻醉，成功后沿颈部正中纵向切开皮肤，钝性分离开皮下筋膜及肌肉组织至双侧颈总动脉，模型组与丁苯肽组每侧颈总动脉用0号手术丝线双结扎，从中间剪断，缝合手术切口。术后保暖，待苏醒，放回清洁笼箱继续饲养。假手术组除不结扎外，亦按上述手术过程操作。术后2周，丁苯肽治疗组按65mg/（kg·只），植物油稀释成2mL给于丁苯肽灌胃，模型组与假手术组仅分别给于2mL植物油，3组均1次/d，连续2月。

1.2.2 Y－型迷宫试验：在光线暗的房间中且周围安静境况下进行试验，先将大鼠放入起步区（大鼠开始所在臂）适应5 min，当安全区信号灯亮起5 s后给起步区与非安全区加电，而安全区不给加电，当大鼠被电击后跑至安全区为一次训练完成。电击后大鼠直接跑至安全区为正确反应。上一次结束后原来的安全区5 s后变为下一次训练的起步区，重复上一次过程。安全区与电击区的位置按顺时针变换，测10次休息5 min，用10次中连续出现9次正确反应前所需的电击次数代表大鼠学习能力强弱。24 h候后，每个大鼠测10次，以正确反应次数代表记忆能力强弱。

1.2.3 免疫组化及Tunel染色：迷宫试验后，将大鼠麻醉，成功后迅速打开胸腔，在右心房剪开一小口，迅速用5 mL针头刺入左心室，快速注入生理盐水，待右心房流出的液体不再含血液后迅速断头取脑，把海马与其他脑组织分离后放入4％甲醛内固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，冠状方向切片（厚约5μm），每只大鼠随机取3张切片分别进行p38 mapk、iNOS免疫组化检测及Tunel染色（严格按说明书进行）。

1.2.4 图像采集、分析及统计学处理：每张切片选取面积大致相同的3个视野，用德国Lecia显微照像系统和Biosens Digital Imaging System v1.6系统，测定灰度值及计算细胞凋亡百分比，取三视野平均值做为该切片最后结果，做为该大鼠观测值。数据均用均数±标准差±s）表示，用SPSS17.0统计软件，单因素方差分析，组间用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠学习记忆能力（次数）比较 见表1。

表1 3组大鼠学习、记忆能力±s）

表1 3组大鼠学习、记忆能力±s）

注：与假手术组比较，△P＜0.05；与模型组比较，○P＜0.05

组别 n 学习 记忆假手术组14 34.07±3.09 8.07±1.07模型组 14 74.21±3.01△ 4.64±1.49△丁苯肽组 14 60.78±4.26○ 6.42±1.45○

2.2 3组大鼠海马区p38 MAPK、iNOS阳性区平均灰度值及细胞凋亡百分比比较 见表2。

表2 3组大鼠海马区p38 MAPK、iNOS阳性区平均灰度值及细胞凋亡百分比±s）

表2 3组大鼠海马区p38 MAPK、iNOS阳性区平均灰度值及细胞凋亡百分比±s）

注：与假手术组比较，△P＜0.05；与模型组比较，○P＜0.05

组别n p38MAPK iNOS 凋亡百分比假手术组14 10.20±2.32 7.07±2.33 5.07±2.40模型组 14 70.72±4.81△72.51±4.80△61.92±4.19△丁苯肽组14 65.02±4.14○67.11±4.15○35.00±3.32○

3 讨论

学习记忆障碍是血管性痴呆常见症状。学习记忆在脑内有一定功能区域位，该位置损害常引起学习记忆障碍。海马是与学习记忆有密切关系的主要功能区，在缺血情况下极易损伤，为缺血易损区之一［1］，损伤后常引起学习记忆障，近来研究认为海马缺血性损伤为血管性痴呆的病理基础［2］。研究发现，血管性痴呆动物海马区存在iNOS和p38MAPK高表达［3－4］。而iNOS是NO合成酶之一，在正常情况下不表达或极少量表达，在缺血缺氧等应激时持续表达，合成过量NO；过量NO可引发细胞凋亡［5］，引起认知障碍［6］。p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路中的重要分子，p38MAPK不仅与炎症等密切相关，还参与细胞的凋亡过程，缺血缺氧状态下其表达增多且被激活后可调节Bc1－2［7］以及bax流入线粒体［8］，引起神经细胞凋亡，造成学习记忆减退［9］。

在本实验中，我们借助免疫组化法对3组大鼠海马区p38MAPK及iNOS的表达情况做一检测，发现模型组大鼠的确存在着明显表达，这与以往研究结果基本一致。在丁苯酞组中，二者也存在着表达，但明显低于模型组（P＜0.05），与假手术组相比，其表达仍然是高的（P＜0.05）。3组大鼠海马细胞凋亡百分比以模型组最高，丁苯肽组次之，假手术组最低（P＜0.05）。3组大鼠学习记忆能力比较，发现丁苯肽组虽不及假手术组，但较模型组明显增强，3组两两比较均有明显统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，我们认为丁苯肽可以用来对血管性痴呆学习记忆障碍的治疗，具体可能是通过降低了iNOS及p38MAPK的表达，减少了海马参与学习记忆细胞的凋亡，从而改善血管性痴呆学习记忆认知障碍，但其具体如何引起iNOS与p38MAPK表达降低有待研究。

［1］Burda J，Matiasova M，Gottlieb M，et al.Evidence for a role of second path physiological stress in prevention of delayed neuronal death in the hippocampal CA1 region［J］.Neurochemres，2005，30（11）：1 397－1 405.

［2］刘斌，姜敏，张晋霞.急性脑梗塞患者认知障碍的临床特征分析［J］.山东医药，2009，49（33）：.

［3］邓医宇，曾红科.诱导型一氧化氮合酶在血管性痴呆大鼠海马中的表达［J］.中华急诊医学杂志，2004，13（17）：606－608.

［4］王雪笠，吕佩源.血管性痴呆小鼠海马p38 MAPK的表达及其意义［J］.中国神经精神疾病杂志，2008，34（2）：83－86.

［5］Elibol B，Soylemezoglu F，Unal I，et al.Nitric oxide is Involved in ischemia－induced apoptosis in brain：a study in neuronal nitric oxide synthase nullmice［J］.Neuroscience，2001，105（1）：79－86.

［6］Nomura Y.Neuronal apoptosis and protection：Effects of nitric oxide and endoplasmic reticulum－related proteins ［J］.Biol Pharm Bull，2004，27（7）：961－963.

［7］王玉，孙黎光.在Fas诱导Bel－7402细胞凋亡中p38MAPK调节Bcl－2的表达［J］.世界华人消化杂志，2007，15（30）：3 184－3 189.

［8］Ghatan S，Lamer S，Kinoehita Y，et al.p38 MAP kinase mediates bax translocation in nitric oxide－induced apoptosis in neurons［J］.J Cell Biol，2000，150（2）：335－347.

［9］Wang T，Liu CZ，Yu JC，et al.Acupuncture protected cerebral multi－infarction rats from memory impairment by regulating the expression of apoptosis related genes Bcl－2 and Bax in hippocampus［J］.Physiol Behav，2009，96（1）：155－161.