刘 宏综述,邓明明审校

(泸州医学院附属医院消化内科,四川泸州646000)

细胞凋亡又称程序性细胞死亡,是局部环境生理或病理性变化引起的、由自身内部机制调节的一种主动的并按一定程序进行的细胞自发性死亡方式。重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)过程中血清、腹水及肝脏各种原因造成的肝损伤都可以出现肝细胞凋亡,肝细胞凋亡是肝脏损伤的表现及机制之一,大量的肝细胞凋亡可造成肝功能障碍,严重时可发展至肝衰竭。因此,了解重症胰腺炎时肝细胞凋亡的机制将有利于重症胰腺炎肝脏损伤的预防及治疗。

1 胰腺炎时引起肝细胞凋亡因素

1.1 胰腺炎相关性腹水(pancreatitis.associated ascitic fluid,PAAF) 近年来发现胰腺炎相关性腹水在胰腺炎肝脏损伤肝细胞凋亡中有着重要的作用,在急性胰腺炎(acute pencreatitis,AP)时形成腹水不仅作为一种损伤体征出现,而且具有很强的致病性,可以促使AP病情进一步加剧,并造成胰外器官的损害。

Takeyama[1]通过动物实验研究发现胰腺炎相关性腹水能够导致肺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞及肝细胞等器官的薄壁细胞凋亡,并导致急性重症胰腺炎器官功能不全。细胞的凋亡数影响重症胰腺炎的死亡率及发病率,控制细胞的凋亡对改善重症胰腺炎的临床愈后有重要的意义。Yang等[2]又进一步发现,向大鼠静脉滴注灭菌的PAAF,同时将离体人肝细胞株(CCL-13)暴露于PAFF 24 h后,大鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(ALT)、丙氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)水平和肝细胞凋亡的数量都明显增加。在 CCL-13中检测到p38-促分裂原活化蛋白激酶(p38-m itogen-activated p rotein kinase,p38-MAPK)的激活,细胞凋亡出现了时间和剂量的依赖性,而caspase-3抑制剂Ⅱ可以减少凋亡。故而认为PAAF通过p38-MAPK的激活和caspase-3依赖的途径引起肝细胞凋亡从而造成了肝损伤。同时也有学者认为,PAAF通过其含有的细胞毒性物质造成了肝细胞凋亡,并发现PAAF导致肝细胞酸中毒、细胞内钠潴留、线粒体内ATP耗竭等,并认为PAAF中含有的血色素可能是造成肝脏损伤的细胞毒性物质之一,PAAF可造成肝细胞内钙超载。这也可能是AP时肝脏受损以及AP造成多器官功能损伤的原因之一。

1.2 弹性蛋白酶 在正常情况下,胰液内的胰蛋白酶原无活性,待其流入十二指肠,受到胆汁和肠液中的肠激酶(enterodinase)的激活作用后乃变为有活性的胰蛋白酶。胰腺炎时因某些因素激活了胰蛋白酶,后者又激活了其他酶反应,如胰蛋白酶对由脂蛋白构成的细胞膜及线粒体膜并无作用,而胰液中的磷脂酶A被脱氧胆酸激活后,作用于细胞膜和线粒体膜的甘油磷脂,使之分解变为脱脂酸卵磷脂,亦称溶血卵磷脂(lysolecithin),后者对细胞膜有强烈的溶解作用,可溶解、破坏胰腺细胞膜和线粒体膜的脂蛋白结构,致细胞凋亡坏死。

Sha等[3]和赵万蓉[4]认为胰蛋白酶是SAP多器官功能障碍的罪魁祸首。弹性蛋白酶正常存在于胰腺腺泡细胞的酶原颗粒和胰液中,被胰蛋白酶激活后水解弹力纤维和多种其他蛋白质.是消化破坏血管壁的关键酶,使血管壁水肿、出血、微循环障碍,从而造成患者早期循环紊乱,多脏器出血、血性胸腔积液及腹水。这种病理变化最明显的是肝脏,因为肝脏是第一个接受最高浓度的胰蛋白酶静脉血流的器官。M urr等[5]利用含胰弹性蛋白酶(1 u/m L)和/或钆(0.5 mg/m L)的灌洗液灌洗鼠的肝脏,胰弹性蛋白酶可以使流出液中AST、ALT、LDH、肿瘤坏死因子(TNF)和细胞坏死凋亡率升高,且组织中TNF-m RNA表达也增加,而钆则可以减弱弹性蛋白酶的这些作用。

由此可见,弹性蛋白酶可以导致类似 AP时的肝损害表现,与弹性蛋白酶的激活可导致ASP时急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发生是一致的,由此而认为弹性蛋白酶是AP时全身多器官衰竭中导致炎症细胞广泛激活的重要因子。

1.3 细胞内Ca2+超负荷 细胞内Ca2+是重要的第二信使,参与细胞的多种生理功能,一旦超负荷将从多方面对细胞造成不可逆的损伤和促凋亡作用。Ueda等[6]用荧光钙离子指示剂Fluo-2/AM检测PAAF原代培养的人肝细胞,发现PAAF可以增加细胞内Ca2+,且在加入PAAF 1 m in后就有细胞内Ca2+的增加。对PAAF成分分析发现,只有分子质量在5×104及其以上的成分同时具有升高细胞内Ca2+和细胞毒性的特性。且细胞内Ca2+释放阻滞剂(TMB-8)和毒胡萝卜素都不能抑制PAAF导致的细胞内Ca2+升高,细胞外Ca2+螯合剂EGTA则能抑制细胞内Ca2+升高。这意味着细胞内Ca2+的增加是由细胞外向细胞内的转运所致。血小板活化因子受体抑制剂(TCV-309)也有阻断作用;胰腺炎相关性血清也有升高细胞内Ca2+的作用,由此认为血小板活化因子在细胞内Ca2+升高中可能发挥着中心环节的作用。1.4 氧化剂诱导肝细胞凋亡 氧自由基(oxygen free radical,OFR)是指氧的某些代谢产物和一些反应的含氧产物,包括超氧阴离子、羟自由基以及其与多不饱和脂肪酸作用后衍生的烷自由基、烷氧自由基、烷过氧自由基、H2O2等统称为活性氧(reactive oxygen species,ROS)。正常时机体内自由基产生极少,且有抗氧化防御系统与之对抗,不会对机体造成损伤。但在病理条件下,如缺血、缺氧、炎症介质释放激活中性粒细胞(PMN)时可大量产生OFR,造成机体的广泛损伤。现已证实,在AP时过度的炎症反应产生大量的细胞因子、血管活性因子,如血管紧张素转换酶(ACE)、血栓素A 2(TXA 2)和前列环素(PGI2)在微循环障碍中起重要作用。另外,由于炎症介质的作用,PMN在各种组织和器官内聚集、活化,众多原因均导致OFR以上述途径大量释放[7]。

已注意到细胞暴露于低水平的氧化剂中容易激发凋亡,如低浓度的过氧化氢可诱导细胞的凋亡,高浓度的则可诱发坏死。

由于肝脏特殊的解剖位置及功能,重症胰腺炎时富含OFR物质的静脉血经门静脉到达肝脏引起肝细胞的凋亡从而引起肝细胞损伤,SAP患者几乎很早都有肝功能异常表现。

1.5 线粒体功能状态与凋亡相关 线粒体在肝细胞凋亡中发挥重要作用,细胞受到凋亡信号刺激后,线粒体发生肿胀,位于线粒体内外膜之间的通透性转换孔道(m itochondriumpermeability transition pore,MPTP)开放,使线粒体外膜电位降低、破裂,线粒体内细胞色素C(cy tochrome C,Cyt C)、凋亡诱导因子(apop/osis.inducing factor,A IF)、Ca2+以及活性氧等释放到胞质中,分别通过破坏核内染色质或激活caspase或作用于其他Ca2+依赖性蛋白,而引起细胞凋亡。

线粒体通过释放出凋亡诱导因子和/或细胞色素C诱导凋亡。如线粒体内膜发生损伤,则可导致线粒体功能的改变和肝细胞坏死 。另外,一系列的单细胞的研究发现,在缺氧或高氧的情况下,激活线粒体的渗透转换能力能促进细胞死亡[8]。

研究发现狗和人的PAAF均可以增加离体培养的鼠肝细胞线粒体呼吸的氧消耗率。并且人的PAAF增加耗氧率的作用更大,线粒体的ATP酶也被激活。进一步研究认为PAAF中的血红蛋白是导致肝细胞损害的主要物质之一。血红蛋白可能是实验中PAAF中存在的可透析性的线粒体毒性物质之一,通过干扰线粒体呼吸功能,导致肝细胞内环境平衡和能量代谢失衡,参与SAP时肝细胞的损害。

2 凋亡相关基因的调控

2.1 Bax和Bcl-2 实验发现,SAP大鼠肝脏的细胞凋亡数明显增多,凋亡指数增高,凋亡发生部位与病理改变明显的部位吻合,肝脏细胞凋亡指数与肝功能的损害程度呈正相关,说明SAP肝脏损伤至少部分是通过细胞凋亡机制引起的,而且细胞凋亡是造成肝功能进一步恶化的重要因素之一。细胞凋亡调控基因中最受关注的就是Bcb-2家族,其中Bcb-2和Pax都是Bcl-2家族成员,Bcl-2的生理功能主要是抑制细胞凋亡,延长细胞寿命。Bcl-2与Bax可形成同二聚体或异二聚体来改变线粒体的通透性,从而决定细胞的生存与死亡。当Bcl-2相对量高于Bax时,Bcl-2同二聚体增多并促进形成Bcl-2-Bax异二聚体,而Bcl-2同二聚体和Bcl-2-Bax异二聚体都可抑制细胞凋亡;相反当Bax的量相对高于Bc1-2时,则Bax同二聚体增多,从而促进细胞凋亡[9]。因而Bcl-2/Bax两蛋白的比例是决定细胞凋亡或存活的关键因素[10]。除此以外,Bcl-2还可以通过直接或间接的影响细胞信号传递蛋白,如抑制WTp53介导的细胞凋亡[11]。而应用DDFA(D:地塞米松,D;低分子右旋糖酐,F:5-氟脲嘧啶,A;抑肽酶)治疗后,Bax基因表达明显下调,而Bel-2基因表达明显上调,Bel-2/Bax比值上升。SAP时随着肝脏凋亡细胞数增多、Bax基因表达明显上升,Bel-2的表达下调,肝功能进一步恶化,DDFA使Bax基因表达明显下调,而Bel-2基因表达明显上调,减少肝脏细胞凋亡可明显改善肝功能。因此认为,DDFA对肝功能的保护作用可能部分是通过调节凋亡相关基因Bax和Bcl-2从而影响细胞凋亡实现的[12]。

2.2 转化生长因子β1(TGF-β1) TGF-β1是一种广泛存在的生长抑制因子,可抑制肝细胞、胃肠道上皮细胞等多种上皮细胞的增殖。有研究发现,在肝脏、枯否细胞、窦状内皮细胞、贮脂细胞和窦周细胞均表达TGF-β1。虽然正常肝脏细胞或刚分离的新鲜肝细胞不表达 TGF-β1的m RNA或蛋白,但培养后的肝细胞和肝细胞瘤中的细胞可获得表达TGF-β1的能力,另外肝脏处于其他疾病时也可检测到有TGF-β1生成,而且和肝细胞的凋亡密切相关。Kusaka等[13]研究发现TGF-β1的含量与肝细胞的凋亡数成正比。Nakamura等[14]发现,大鼠AP时TGF-β1在血浆、PAAF、肝组织和腹膜巨噬细胞中的水平都升高,其中和抗体可以减少肝细胞的凋亡,降低血清谷丙转氨酶,而巨噬细胞的清除明显降低了血浆和PAAF中TGF-β1蛋白的水平,且明显抑制了肝组织中 TGF-β1的激活。因此认为,AP肝损伤与巨噬细胞引起的凋亡有关,而其衍生的TGF-β1是诱导肝细胞凋亡的重要因子。有研究同时发现急性出血坏死性胰腺炎(ANP)时PAAF、血浆和肝组织中有较高的TGF-β1浓度,用TGF-β1抗体中和技术可以减少肝细胞的凋亡。可见PAAF中的 TGF-β1由腹膜巨噬细胞产生,也可经腹膜吸收入血,从而介导远隔脏器细胞的凋亡。

2.3 Kup ffer细胞与Fas/FasL基因 研究发现,AP时Kupffer细胞衍生的 Fas配体(FasL1、p38-M APK)、caspase-3表达增加,并且诱导了肝细胞的凋亡损伤[15-16]。Gallagher等[17]又进一步发现,在Fas/FasL基因敲除大鼠中,AP诱导的p38-MAPK表达显著降低,肝细胞的凋亡也明显减少。推测Fas/FasL在AP肝细胞的凋亡中起关键作用。Peng等[18]通过胆碱缺乏和乙硫氨酸补充饮食(CDE)诱导大鼠AP模型,并用胰弹性蛋白酶在p65 siRNA转染的大鼠离体Kup ffer细胞株中模拟AP损伤模型,实验发现CDE胰腺炎引起p65 NF-kappa B/RelA核转位、Fas/FasL和caspase-3表达增加以及大鼠肝细胞核内DNA断裂。而在体外实验中,p65-siRNA的转染减弱了弹性蛋白酶诱导的p65 NF-kappa B/RelA核转位和Kupfer细胞的凋亡,证明 AP通过 NF-kappa B途径诱导Kupffer细胞凋亡,并认为 Kup ffer细胞衍生的Fas/FasL诱导的肝细胞凋亡和NF-kappa B途径诱导的Kup ffer细胞凋亡之间的平衡失调程度决定了AP时肝脏损伤的程度。

3 阻断肝细胞过度凋亡在重症胰腺炎肝损伤中的应用前景

肝细胞凋亡在重症胰腺炎肝脏损伤中发挥着重要的作用。重症胰腺炎时机体通过多种途径导致肝细胞的凋亡,其中以PAAF的毒性作用及氧自由基损伤和缺血损伤占有重要的作用。大量实验研究发现,重症胰腺炎时肝脏的损伤情况与肝细胞的凋亡呈正相关,且组织损伤与病理改变相符合。对于肝细胞凋亡在重症胰腺炎时肝脏损伤中作用的认识,促使人们探讨新的阻止肝细胞死亡的方法来治疗及预防重症胰腺炎对肝脏的损伤。有研究发现,对重症肝炎的小鼠注射抑制caspase蛋白酶核心的三肽,可以阻止肝细胞凋亡和肝功能衰竭的发生,使小鼠的肝脏功能改善。熊去氧胆酸可通过结合并排出有毒的胆盐阻止凋亡,这种胆盐存在于鼠的肝细胞线粒体中,可以阻止线粒体的渗透性转换,保护线粒体功能。

如何阻止肝细胞的过度凋亡,将成为治疗重症胰腺炎肝脏损伤及肝病研究领域的新的热点,也将为胰腺炎肝脏损伤的治疗带来新的方法。

[1]Takeyama Y.Significance o f apop totic cell death in system ic comp lications with severe acute pancreatitis[J].J Gastroenterol,2005,40(1):1.

[2]Yang J,Fier A,Carter Y,et a l.Liver iniury during acute pancreatitis:the role of pancreatitis-associated ascitic fluid(PAAF),p38-MAPK,and caspase-3 in inducing hepatocyte apoptosis[J].JGastrointest Surg,2003,7:200.

[3]Sha H,M a Q,Jha RK.Trypsin is the cu lp rit of mu ltip le organ in jury with severe acute pancreatitis[J].Med Hypotheses,2009,72(2):180.

[4]赵万蓉.急性重症胰腺炎诊断治疗进展——诊断和内科治疗[J].重庆医学,1996,25(5):300.

[5]Murr MM,Yang J,Fier A,et al.Pancreatic elastase induces liver injury by activating cy tokine p roduc tion w ithin Kupffer cells via nuclear factor-Kappa[J].B JGastrointest Surg,2002,6(3):474.

[6]Ueda T,Takeyama Y,Takase K,et al.H ematin is one of the cy totoxic factors in pancreatitis-associated ascitic fluid that causes hepatocellular injury[J].Surgery,2002,131(1):66.

[7]白启轩,冯子坛,于兰,等.氧化损伤与急性胰腺炎所致多脏器损伤的研究进展[J].临床误诊误治,2006,19(11):71.

[8]肖经纬.肝细胞凋亡机制及其检测方法的研究进展[J].国外医学卫生学分册,2006,33(2):93.

[9]Yu XD,Wang SY,Chen GA,et al.Apoptosis induced bv depsipeptide FK228 coincides with inhibition of survival signaling in lung cancer cells[J].Cancer J,2007,13:105.

[10]Jung JW,Cho SD,Ahn NS,etal.Augmentation of sodium buty rate-induced apop tosis by p38M AP kinase inhibition in rat liver epithelial cells[J].Antioxid Redox Sienaf,2005,7:1767.

[11]张毓芳,刘恩桥.细胞凋亡与心血管疾病研究进展[J].中国心血管杂志,2004,9:385.

[12]何邹骏,方驰华,朱明德.DDFA对重症急性胰腺炎大鼠肝脏细胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2006,15(2):220.

[13]Kusaka K,Imamura H,Tomiya T,et al.Exp ression of transform ing grow th factor-alpha and-beta in hepatic lobes after hemihepatic portal vein embolization[J].Dig Dis Sci,2006,51(8):1404.

[14]Nakamura H,Tashiro M,Yamaguchi T,et al.Preferential increase o f extracellu lar matrix exp ression relative to transforming grow th factor beta1 in the pancreas during the early stage of acute hemorrhagic pancreatitis in rats[J].Pancreas,2007,35:e23.

[15]Gallagher SF,Yang I,Baksh K,et a l.A cute pancreatitis induces FasL gene exp ression and apoptosis in the liver[J].Surg Res,2004,122:201.

[16]Yang J,Gallagher SF,Haines J,et al.Kup fer cell-derived Fas ligan d p lays a role in liver uryan dhepatocy te death[J].Gastrointest Surg,2004,8:166.

[17]Gallagher SF,Peng Y,Haines K,et al.Fas/FasL p lay a central ro le in pancreatitis-induced hepatocyte apop tosis[J].Gastrointest Surg,2005,9:467.

[18]Peng Y,Gallagher SF,Landmann R,etal.The ro le of p65 NF.kappaB/RelA in pancreatitis induced Kupffer cellapoptosis[J].R Gastrointest Surg,2006,10:837.