孙 婷综述,晏洪波审校

(广州军区武汉总医院皮肤科,武汉430070)

家族性肿瘤样钙沉着症(fam ilial tumoral calcinosis,FTC)是一组常染色体隐性遗传病。主要病理改变为软组织异位钙化,可导致皮肤和骨的2次感染,常伴动脉瘤,牙齿异常,亦可见皮疹。常规治疗手段对该病无稳定疗效,包括限磷饮食、钙螯合物(乙二胺四乙酸)、双磷酸盐类药物、皮质类固醇、碳酸酐酶抑制剂(乙酰唑胺)及钙化组织切除。

1 FTC的分类

FTC的发病率无确切报道,主要见于中东或非洲裔家族,最近也有少量白人病例报道。目前亚洲人中仅少数病例个案,未见相关分子遗传学研究报道。FTC有2种类型:高磷酸血症型(H FTC,M IM 211900)和正常磷酸血症型(NFTC,M IM 610455)。

H FTC主要表现为大关节周围皮下组织的钙质沉积,有报道磷酸钙结晶可达1 kg以上;同时伴甲状旁腺激素和维生素D代谢产物的异常,继发性肾小管及小肠磷重吸收增加,血磷升高显著[1]。HFTC已有多例关于内脏钙化的报道[2],但NFTC暂未观察类似病例。目前发现与H FTC发病相关的主要有GALNT3基因、FGF23基因和KLOTHO基因。

NFTC中多见较小钙化,常发于组织损伤及炎症部。有推测其是因炎症调节过度导致。该类患者通常伴有炎症(如结膜炎、牙龈炎)或一系列看似无明显关联的因素,如血管性疾病、癌症、自身免疫性疾病等;钙磷代谢及甲状旁腺激素水平无明显异常。在Topaz等[3]观察的5个犹太家庭NFTC病例中,皮损活检显示大量磷酸钙结晶沉积在真皮中部及深部,所有患者早期皮损处均存在红色素沉着。序列分析提示该病与SAMD9基因突变相关。

2 FTC相关基因

2.1 FGF23基因及其突变分析

2.1.1 FGF23基因及其编码蛋白 成纤维生长因子23(fibroblastgrow th factor-23,FGF23)是成纤维细胞生长因子家族成员之一,为32×103的 O型糖化蛋白。其与人 FGF21及FGF19分别具有24%和22%的同源性,在N端拥有一个含24个氨基酸的信号肽。人FGF23基因定位于12号染色体p13.3,基因序列跨越10 kb,拥有3个外显子。FGF23主要表达于骨细胞,远程调控肾脏磷酸盐代谢,具有内分泌激素特征。FGF23在胞内首先以无活性形式合成,经枯草杆菌样蛋白转化酶(SPCs)对介于A rg179和Ser180之间(RHTR179)序列进行胞内加工,最终形成完整地活化形式,包含:一个N端片段,其构成FGF蛋白家族β筒结构(βbarrel);及一个高保守的C端片段。该加工步骤对FGF23的调节磷平衡功能必不可少。

2.1.2 FGF23与磷酸盐代谢 FGF23主要通过抑制1α-羟化酶活性及减少钠-磷共转运蛋白Ⅱa(NaPiⅡa)表达实现调磷功能。1,25-(OH)2 d3是维生素D3的活化形式,可促进肾小管对磷重吸收。体内维生素D3首先在肝脏被25-羟化酶催化生成25-(OH)2 d3,后者于肾脏经1α-羟化酶催化转变为1,25-(OH)2 d3。FGF23基因敲除(FGF23-KO)小鼠表现高血磷,肾磷酸盐重吸收增加和1,25(OH)2d3水平升高,FGF23突变小鼠与其表现类似;当诱导1α-羟化酶突变后,小鼠因血磷升高导致的衰老症状得到缓解,说明FGF23是通过抑制1α-羟化酶的活性而实现血磷调节[4]。NaPiⅡa属于钠离子依赖性磷酸盐协同运输因子,严格控制肾磷酸盐重吸收,NaPiⅡa缺陷大鼠肾近端小管的磷重吸收减少80%。给小鼠静脉注射5μg完整FGF23蛋白,可使8 h内肾脏NaPiⅡa蛋白减少,血磷降低20%～25%。FGF23-KO小鼠在出生6周时,肾近端小管的最大磷转运率(Tm P/GFR)显著增加,同时近端小管顶端的NaPiⅡa蛋白水平显著增加。推测FGF23可促使NaPiⅡa内移和降解,并抑制其表达。

FGF23亦受一个反馈机制的调节。高磷酸盐食物或高血磷可使骨骼FGF23表达增加[5],随之FGF23作用于肾脏靶细胞,最终降低血磷。给大鼠注射大量1,25-(OH)2 d3(增强磷的重吸收而升高血磷)可以显著升高血清FGF23浓度。相反,当血磷降低,则FGF23表达受抑制,从而活性维生素D3及NaPiⅡa表达增加而血磷升高。这个精密的反馈机制实现了机体稳定的血磷环境。

2.1.3 HFTC中FGF23突变类型 FGF23功能获得性突变可导致常染色体显性遗传低磷血症性佝偻病(M IM 193100),该病特征为肾小管磷排泄增加和骨量丢失。由于该病多方面代谢特征与HFTC呈镜像表现,研究者提出HFTC与FGF23功能缺陷相关的可能。随后,多个实验室均有报道FGF23功能缺失的患者表现出HFTC特征。

综合目前的病例报告,FGF23基因突变多见于酶切基序中(R176Q,R179Q,R179W)。推测这些突变导致FGF23稳定性降低,完整活性FGF23分泌减少。Benet-Pagès等[6]报道了1例新的FGF23基因纯合突变(S71G,ser71-to-gly)患者,该突变位于 N-末端β-barrel结构,与酶切位相差约100个氨基酸。患者表现出典型HFTC症状及内脏钙化。这种错义突变减少/甚至停止了完整FGF23的分泌。2009年 Lammoglia等[7]报道1例3岁高加索女性病例,血磷显著升高,左肘部大块钙化导致皮肤溃疡;其7个月大的妹妹血磷偏高,但可能由于年龄较小,未观察到异常钙化。二者均无齿龈异常发现,而既往认为这一点在确定该病症是否为遗传传播方式时至关重要。序列分析表明,患者为FGF23错义突变纯合子(c.367G 1 T,p.Gly 123 Trp),其父母是突变基因的携带者。经过磷酸盐黏合剂司维拉姆(sevelamer)及碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺(acetazolam ide)联合治疗,患者血磷水平降低,钙化块减小。

综合目前研究资料,HFTC中的FGF23突变多可直接影响到蛋白酶识别位点,导致这些位点O型糖基化减少,因此增强FGF23降解的易感性,或直接降低FCG23活性。针对这一特点,有学者提出通过修复FGF23蛋白结构治疗FTC的设想,目前未见深入报道。

2.2 GALNT3基因及其突变分析

2.2.1 GALNT3与磷酸盐代谢 人GALNT3基因位于21号染色体 q24-q3区域,该基因全长约 46.49 kb,包含10个外显子,为多肽N乙酰氨基半乳糖转移酶(UDP-GalNA c:po lypeptide N-acetylgalactosam iny l-transferase,ppGalNacT)基因家族成员。其负责编码 UDP-N-乙酰-α-D-氨基半乳糖转移酶3(ppGalNacT3),由 633个氨基酸组成,各组织广泛表达,其中胰腺、睾丸高水平表达。ppGalNacT是催化黏蛋白O型糖基化的起始酶,可将糖基供体UDPGalNA c中的GalNac基团转移至多肽链中的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)羟基上,形成α糖苷键。研究证明ppGalNacT家族成员在整个演化过程中高度保守,提示O型糖基化对人类生理的重要性。HFTC是目前惟一已知的由半乳糖转移酶突变导致的临床疾病。

ppGalNacT3的调磷机制仍未完全明确。其对FGF23的SPCs识别序列基元选择性 O型糖基化,这一过程可抑制FGF23降解[8]。GALNT3突变被认为可增加FGF23蛋白水解和/或降低FGF23活性。此外,ppGalNacT3可作用于其他靶分子以影响磷酸盐水平,如各种磷酸盐联合转运因子,包括被认为可调控FGF23合成的磷酸盐调节因子(PHEX)、牙本质基质蛋白1(DMP1)等[9]。

2.2.2 HFTC中GALNT3突变类型 HFTC病例中GALNT3突变范围广泛,包括剪切位点和编码区,如(GLN 481TER),(IVS1AS,A-T,-2),(ARG 162TER),(IVS7,G-A,+1)(IVS7DS,G-A,+5),(TYR322TER)[10-14],临床表型各异。

2006年Speck tor[15]报道了1例GALNT3纯合型突变(GLN 592TER),患者为一名北欧男性,有严重的关节病和齿龈异常症状,实验室检测符合 H FTC诊断。该报道提示HFTC具有较以往构想更广泛的地理分布。Kelly等[16]对一非洲裔HFTC家族进行近40年临床观察,父母健康,16个子女中7人受累,随后的子辈13人和孙辈7人无HFTC临床表现。患者GALNT3基因出现外显子1的无义突变(484C-T),及外显子7杂合突变(IVS7+5G-A,ARG162TER)。7例患者症状轻重不一,40年间分别经历了4～36次手术治疗,复发率高。其中3名患者出现该病的静止期(7年,12年和15年)。由此可见,相同的突变位点在家族发病成员中表型差异巨大。这说明基因突变位点与表型存在复杂的关系。同时提示,虽然传统认为出现H FTC至少需要双等位基因突变,但是1个基因突变就足够导致生化异常。

于是,有学者对HFTC的常染色体隐性遗传方式提出质疑。Ichikawa等[12]对一个HFTC患者家族的GALNT3基因进行了突变分析,确认内含子1存在新的剪切点突变(IVS1-2a3t)。先证者是该剪接位点杂合突变与一无义杂合突变的复合型(484C3T;R162X),其舅舅携带剪接位点纯合突变,也表现出HFTC症状。进一步分析这个家族中的GALNT3基因序列,发现2个典型 HFTC表型者(Ⅱ-5和Ⅳ-6)携带了双等位基因的突变(R162X和或ⅣS1-2a3t)。R162X的突变可能导致翻译提前终止。剪接位点的突变会导致外显子2的缺失,从而删除GALNT3蛋白的关键部分。这似乎提示该家族有准常染色体显性遗传病,即GALNT3杂合突变可导致生理异常。

2006年Ichikawa等[17]报道1例25岁女性患者,呈现眼睑钙化及高磷血症。该患者既往无相关病史,X线检查无异位钙化,仅表现出更多与其年龄不符的钙化肋软骨。患者GALNT3突变出现在外显子 3(T272K)和5(T359K)。既往HFTC病例中均未发现孤立眼睑钙化。这一发现提示:可能有一系列弱表型存在;H FTC发病也许较以往学者想象的更为普遍。但不能排除这些患者的状况有继续恶化的可能。

随后 Ichikaw a等[18]观察了 1例GALNT3突变导致的骨肥厚-高磷酸盐综合征(HHS)。X线检查显示,这位5岁的法籍男孩腿部骨骼增生,并导致皮肤病变。皮损组织由不成熟小梁结构和纤维组织包绕的编织骨组成。与HFTC相似的是:完整FGF23血清水平低于正常,FGF23 C末端明显升高。由此有研究者提出,HHS和HFTC是同一种疾病的不同表现型。

2.3 K lotho基因及其突变分析

2.3.1 K lotho主要功能 1997年Matsumura等在研究老年性疾病时从小鼠模型中克隆出与衰老相关的基因,即K lotho(KL)基因。人KL基因定位于13号染色体q12,全长约50 kb,包含5个外显子和4个内含子。KL基因的操纵子内没有TA TA盒和CAAT盒,但有5个潜在的sp1结合位点,外显子1及其侧翼序列存在 CPG岛。研究表明,KL基因结构中,mRNA存在一个选择性RNA剪切位点,该位点如果接受了一个50 bp片段的插入,该插入序列末尾2个核苷酸TA就会与外显子4的第1个核苷酸G构成终止密码TAG,形成一个短的开发阅读框,仅3个外显子和2个内含子参与编码形成分泌型KL蛋白。如果缺乏这个50 bp的插入序列,其mRNA就是完整结构,编码形成一种膜型KL蛋白。膜型K L蛋白由1 012个氨基酸组成,为单跨膜蛋白,包括1个N末端信号序列,1个单跨膜区,1个短的胞内区,及由2个与β-葡萄糖苷酶有20%～40%同源性的内部重复片段KL1和KL2组成的胞外区。其中KL1和 KL2蛋由保守序列 Lys-Lys-A rg-Lys连接在一起,可能是蛋白酶裂解位点,该位点可释放小肽作为体液因子发挥作用。由549个氨基酸组成的分泌型KL蛋白仅含N末端序列和K L1胞外区。人K L基因广泛表达,其中分泌型KL蛋白在所有被检组织均占表达优势。

最初研究表明K L蛋白是一种与年龄、衰老性疾病密切相关的抗衰老因子。KL基因缺失小鼠会出现骨质减少、皮肤和肌肉萎缩、肺气肿、不育、软组织钙化和60 d内死亡等典型早衰症状。KL表达不足的小鼠生化异常包括:血磷及血钙升高,低血糖和1,25(OH)2 d3血清浓度升高。该表型与FGF23失活小鼠模型症状相似;这指示KL和FGF23有明显功能交叉。随后的体内、体外实验证明,KL参与介导FGF23信号传导途径[19]。肾匀浆实验发现,KL可与FGF23结合;体外培养肾细胞的KL强行表达可使FGF23与细胞表面亲和力升高,并恢复了肾细胞系FGF23的应答能力;随后对小鼠注射野生型KL单克隆抗体,小鼠FGF23功能缺失。这一系列发现提示KL对内源性FGF23功能必不可少。但单由KL似乎无法得到细胞内信号,U rakaw a进一步发现FGF23受体的另一元件(FGFR1(Ⅲc)),通过KL直接转换为FGF23受体。即KL和FGFR1(Ⅲc)协同作用,重组形成 FGF23受体。

2.3.2 HFTC中KL基因突变类型 2007年Ichikaw a等[20]报道了第 1例 KL基因纯合型突变(H IS193ARG)导致的H FTC。患者为一名13岁女性,外踝和鱼际肌轻度肿胀,无发红、发热。实验室检查显示,血磷升高,FGF23活性增加,血清钙和甲状旁腺激素亦有升高。X线片显示,骨质疏松,多处钙化斑块,颅内、硬脑膜和颈总动脉均有钙化。通过不完全性甲状旁腺腺体增生治疗,患者症状缓解。

KL基因突变导致HFTC与FGF23信号传递有明显关联。但KL突变患者未出现类似于KL表达不足小鼠的早衰症状,人类可能通过某种方式减少KL的功能缺失对其他代谢过程的影响。KL基因对钙、磷代谢的影响还需要通过更多病例观察以明确。

2.4 SAMD9基因及其突变分析 人SAMD9基因定位于7号染色体q21-q21.3,包含3个外显子。启动子区域包含TATA信号盒和淋巴细胞增强因子(LEF)的结合元件,并有多个选择性转录起始位点,腺苷酸多聚位点和至少2个选择性剪切位点。SAMD9蛋白由1 589个氨基酸组成,组织表达范围广泛,包括皮肤,而以血管内皮细胞表达强度较高,其次为成纤维细胞。除SAMD9L蛋白外,SAMD9与极少的蛋白具有同源性。实验证明,SAMD9在维持细胞活力与增殖,诱导细胞凋亡、肿瘤生长等方面均有重要作用[21]。亦有数据证实SAMD9通过TGF-β信号转导通路参与骨外钙化的调节[22]。

2006年 Topaz等[23]第1次报道了8例与SAMD9相关的NTFC,呈 SAMD9突变纯合型(K 1495E,LYS1495GLU),均为也门犹太裔。K 1495跨物种高度保守性质提示该位点的生理重要性。2008年Topaz等[22]再次对另一也门犹太裔家族的NTFC病例进行评估,患者均为K 1495E和R344X(一种既往无报道的无义突变)的复合性杂合突变型,预计将产生显著的截短分子。考虑到NTFC的罕见和也门犹太裔族群的小规模,SAMD 9基因突变也可能是基因漂变和种族差异性修饰的反应。目前关于SAMD9功能仍未探明,SAMD9在调节钙磷平衡中的功能还有待观察。

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