战 宇，曾庆祝，方 玲

(广州大学化学化工学院，广东 广州 510006)

亮叶杨桐叶总类黄酮的提取工艺优化及对肺腺癌细胞A549生长的影响

战 宇，曾庆祝，方 玲

(广州大学化学化工学院，广东 广州 510006)

采用响应面法对亮叶杨桐叶中类黄酮物质的提取工艺条件进行优化。结果表明，提取时间10min、乙醇体积分数63%、提取温度70℃、比料液1:20时，亮叶杨桐叶中总类黄酮提取率为(95.58±0.49)%。采用MTT法对亮叶杨桐叶类黄酮抗肺腺癌细胞A549生长的活性进行研究，结果显示亮叶杨桐叶类黄酮对肺腺癌细胞A549具有良好的抑制作用，并呈现显著的时间效应和剂量效应关系。

亮叶杨桐；类黄酮；提取条件；生理活性

亮叶杨桐(Adinandra nitida Merr. Ex H. L. Li)是一种主要分布于我国广西、广东和贵州等省区的天然野生植物资源，以其鲜嫩叶制成的代茶——石崖(芽)茶在华南民间有着悠久的饮用历史，具有消炎、解毒、降压、退热、止血、杀菌、镇痛等多种功能[1]。近年来研究发现，亮叶杨桐富含以芹菜素为苷元的类黄酮，主要为山茶苷A[2]，其次含有少量的山茶苷B及芹菜素，总量可达28.4%[3]。药理学研究证明，芹菜素具有抗高血压、抗炎症、抗溃疡、抗HIV的活性，其中抗肿瘤作用最为突出[4-6]。因此，从廉价易得的亮叶杨桐叶中制备高附加值的黄酮类化合物，深度开发和高效利用丰富的亮叶杨桐植物资源，对促进华南山区经济发展具有重要的现实意义。本实验采用响应面试验设计(response surface method，RSM)对亮叶杨桐叶中总黄酮的提取工艺条件进行优化，并采用MTT法对亮叶杨桐叶中所含的类黄酮的抗肿瘤活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亮叶杨桐干叶：2008年春购于广西省来宾县，粉

碎后过50目筛备用；芹菜素(纯度98%) 陕西慧科植物开发有限公司；山茶苷A(纯度98%以上) 实验室自制；肺腺癌细胞A549 美国ATCC公司；DMEM培养基(含25mmol/L Hepes缓冲液、60mg/L青霉素、100mg/L链霉素以及2g/L碳酸氢钠)、RPMI 1640培养基、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜 美国Sigma公司；胎牛血清Gibco公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TA2004电子天平 上海天平仪器厂；752紫外-可见分光光度计 上海精密仪器有限公司；RE-52旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器公司；SHZ-D(Ⅱ)循环水式真空泵 巩义市英裕予华仪器厂；DHG-9000A电热恒温鼓风干燥箱 上海博讯公司医疗设备厂；Elisa酶标仪TECAN公司。

1.3 亮叶杨桐叶总类黄酮提取工艺参数的优化

1.3.1 溶剂的选择

实验发现用水做溶剂时，溶剂用量大，固形产品回收困难，特别是在较高温度时，杂质含量大，不但影响产品纯度而且过滤困难。乙醇作为溶剂时对类黄酮化合物具有较好的溶解性，不易引入较多杂质。甲醇作溶剂提取率与乙醇相差不大，但甲醇容易挥发且有毒，因此本实验采用乙醇作为提取溶剂。

1.3.2 单因素试验

提取温度、乙醇体积分数、提取时间、液固比、提取次数5个因素会影响总类黄酮的提取率。考虑到乙醇的沸点及成本，设定提取温度变化范围为30～70℃，乙醇体积分数为40%～100%；提取次数为1次。为确定提取时间与液固比的变化范围，实验考察上述因素对提取率的影响。

类黄酮化合物提取率/%＝(提取出的类黄酮化合物的质量/亮叶杨桐中含有的类黄酮化合物的质量)×100。已用体积分数80%乙醇溶液对亮叶杨桐叶进行10h索氏提取，紫外分光光度法测得类黄酮化合物含量为(31.84 ±0.42)%。提取液的类黄酮化合物的质量，通过紫外分光光度法在330nm波长处测定吸光度，再用以山茶苷A为标样制作的标准曲线计算而得。标准曲线回归方程：y＝31.348x－0.976，R2＝0.9982。

1.3.3 响应面试验

采用Design-Expert 7.0中的响应面试验设计法，设计4因素共30个试验点，24个析因点，6个中心点。

1.4 亮叶杨桐叶类黄酮抗肿瘤活性的研究

1.4.1 亮叶杨桐叶类黄酮溶液的制备

称取一定量的亮叶杨桐干叶，在优化的工艺条件下提取总类黄酮，所得提取液抽滤后，在40℃的条件下真空旋转浓缩，蒸去乙醇后的残余物冷冻干燥，所得固态产品测定总类黄酮含量为(31.84±0.42)%，山茶苷A含量为(27.57±0.92)%，以蒸馏水溶解，备用。

1.4.2 细胞培养

A549细胞分别接种于RPMI 1640培养基和含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5% CO2孵育，每周传代2次。取对数生长期细胞进行实验。

1.4.3 MTT实验

将A549细胞接种于96孔培养板中，每孔细胞密度为2×104/mL，分别加入终质量浓度为20、10、2.5、1.25、0.625mg/L的亮叶杨桐叶类黄酮溶液，分别培养24、48、72h。对照组则加入培养液，每组各设3个复孔。每孔加入1μg/mL MTT各100μL，避光、37℃、5% CO2条件下继续孵育4h后终止培养。将培养板于1100r/min离心5min，弃去上清液。每孔加入200mL DMSO，振荡15min，使结晶物充分溶解。将培养板置于酶标仪上，测定各孔在570nm和630nm处的光密度值，计算亮叶杨桐叶总类黄酮对A549细胞的细胞抑制率，绘制生长抑制曲线。采用DPS9.5软件包中连续变量的概率单位分析法，计算亮叶杨桐叶类黄酮对A549细胞的半数抑制浓度(50% concentration of inhibition，IC50)[7]。

细胞抑制率/% ＝(1－实验组OD值/对照组OD值)×100

2 结果与分析

2.1 提取时间对亮叶杨桐叶总类黄酮提取率的影响

图1 提取时间对提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida

如图1所示，在提取温度50℃、液固比20:1、乙醇体积分数80%条件下，改变提取时间研究其对提取率的影响。结果表明，当提取时间超过10min后，提取率上升趋缓，这说明亮叶杨桐叶类黄酮的提取是一个非常迅速的过程，因此RSM实验中的提取时间变化范围设定为10～40min。

2.2 液固比对亮叶杨桐叶总类黄酮提取率的影响

如图2所示，在提取温度50℃、提取时间15min、乙醇体积分数80%条件下，改变液固比观察其对提取率的影响。结果表明随着液固比的增大，提取率迅速上

升，当液固比超过20:1时，提取率上升趋缓，而当液固比低于10:1(mL/g)时，提取操作不便，因此将RSM实验中液固比的变化范围设定为10:1～30:1(mL/g)。

图2 液固比对提取率的影响Fig.2 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida

2.3 亮叶杨桐叶总类黄酮提取工艺参数的优化

表1 响应面试验因素及其取值范围Table1 Factors and levels in response surface design

表2 响应面试验设计及结果Table2 Response surface design layout and experimental results

表3 响应面试验方差分析Table3 Variance analysis for extraction rate of total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida with various extraction conditions

表1为响应面试验验因素及其变化范围，表2为响应面试验设计及结果。

表3为响应面试验的方差分析结果，在选定的试验范围内，提取时间和液固比对提取率的影响不显著(P值分别为0.9982、0.2082)。水浴温度和乙醇体积分数对提取率的影响显著(P=0.001)，且水浴温度和乙醇体积的交互作用对提取率也有影响(P=0.0739)。

将实验结果按标准二次项多项式回归，回归方程为：提取率＝1.04342－0.21570A＋0.35430B＋2.11642C＋1.67033D－4.57708×10-3AB－2.98750×10-3AC＋ 5.48472× 10-3AD－0.012228BC＋4.83437×10-3BD＋3.29375×10-3CD＋2.40312×10-3A2＋3.89254×10-4B2－0.036843C2－0.016888D2

由图3各单因素对亮叶杨桐叶总类黄酮提取率的影响可知，当提取时间超过10min后提取率上升趋缓，这与单因素试验结果相符，充分说明本实验中类黄酮的提取是一个非常迅速的过程。吕丽爽等[8]在研究芦蒿中黄酮类化合物提取时也曾出现这种现象。本实验的提取时间如此之短可能是由于以下原因：①粉碎后，物料粒度较细，表面积增大，且植物组织结构遭到了一定的破坏；②乙醇是一种穿透细胞壁很强的溶剂；③物料中类黄酮含量很高，提取时内外浓度差高，有利于缩短提取时间。

提取温度对提取率的影响：随着提取温度升高，分子运动速度加快，溶剂黏度降低，其渗透、溶解、扩散速度加快，所以在不超过溶剂沸点的前提下，随着提取温度升高提取率会逐渐上升。

液固比对提取率的影响：随着液固比的增大，可降低提取液的浓度，有利于可溶成分从细胞内向细胞外扩散，但当液固比超过20:1时，提取率无显著变化。

图3 单因素对提取率的影响Fig.3 Single-factor investigations into the effects of various extraction conditions on extraction rate of total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida

乙醇体积分数对提取率的影响：当乙醇体积分数高于40%时，随着乙醇体积分数的增大类黄酮的提取率增加，当乙醇体积分数达到60%左右时，类黄酮在溶剂中的溶解度最大、提取率最高，随着乙醇体积分数的继续增加，类黄酮提取率下降，这可能是由于一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，这些成分与黄酮类化合物竞争与乙醇分子结合，导致类黄酮的提取率下降。这与张德权等[9]报道的60%左右体积分数的醇类适于提取类黄酮苷类的结论一致。

进一步使用Design-Expert 7.0优化类黄酮提取条件，经典型性分析获得的总类黄酮提取最适工艺条件为提取时间10min、乙醇体积分数63.04%、水浴温度70℃、液固比19.58，理论总黄酮得率为99.64%。考虑到实际操作的可行性和便利性将提取工艺条件修正为提取时间10min、乙醇体积分数63%、提取温度70℃、料液比20:1，经3次实验确认，亮叶杨桐叶总类黄酮的实际得率为(95.58±0.49)%。

2.4 亮叶杨桐叶类黄酮抗肿瘤活性的研究

图4 亮叶杨桐叶类黄酮对肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida on the proliferation of lung cancer A549 cells

如图4所示，亮叶杨桐叶类黄酮对肺腺癌细胞A549具有一定的抑制作用，20mg/L亮叶杨桐叶类黄酮作用72h后，对A549细胞的抑制率达到58.4%。且亮叶杨桐叶类黄酮对A549细胞的抑制作用呈现显著的时间－效应和剂量—效应关系。同一作用浓度下，随作用时间的延长亮叶杨桐叶类黄酮抑制A549细胞的效果也越好；而在作用时间相同的情况下，亮叶杨桐叶类黄酮浓度越高则对A549细胞抑制率也越高。当作用时间为72h时，亮叶杨桐叶类黄酮对A549细胞的IC50为13.5μmol/L。

从细胞形态上观察，未添加亮叶杨桐叶类黄酮的对照组细胞生长良好，细胞大小均匀，形态一致，胞质丰富，死细胞较少。而在加入亮叶杨桐叶类黄酮化合物72h后，肿瘤细胞数量明显减少，细胞大小不一，细胞核固缩，胞质减少，死细胞较多。表明亮叶杨桐叶类黄酮对A549细胞具有一定的抑制作用。

文献资料[10-15]显示黄酮类化合物所具有的抗肿瘤活性可能的作用机理包括抑制蛋白酶体、抑制脂肪酸合成、抑制拓扑异构酶、抑制磷脂酰肌醇3-激酶、诱导细胞周期阻滞、累积肿瘤抑制基因p53及增强原癌基因c-fos和c-myc的表达等。亮叶杨桐叶类黄酮抑制肺腺癌细胞A549生长的具体生理机理有待于进一步研究。

3 结 论

采用响应面试验设计，以粉碎的亮叶杨桐叶为原料、乙醇-水为溶剂，恒温振荡提取总类黄酮的最适工艺条件为：提取时间10min，乙醇体积分数63%，提取温度70℃，料液比1:20，总类黄酮得率为(95.58± 0.49)%。采用MTT法对亮叶杨桐叶中类黄酮物质抗肺腺癌细胞A549生长的活性进行了研究，结果显示亮叶杨桐叶类黄酮对肺腺癌细胞A549具有良好的抑制作用，作用72h时的IC50为13.5μmol/L，具体的抑制机理有待于进一步研究。

[1]廖文波, 苏志尧. 粤北南方红豆杉植物群落的研究[J]. 云南植物研究, 2002, 24(3): 295-306.

[2]刘本国, 战宇, 宁正祥, 等. Characterization and antioxidant activity of flavonoid extract from leaves of Adinandra nitida Merr. ex Li[J]. 林产化学与工业, 2008, 28(1): 6-10.

[3]余杰, 陈美珍. 亮叶杨桐中类黄酮提取及其抗氧化,抑菌作用的研究[J]. 汕头大学学报: 自然科学版, 1997, 12(2): 52-58.

[4]厉强, 马建仓. 芹菜素的药理学研究进展[J]. 国外医学: 中医分册, 2003, 25 (3): 147-149.

[5]孙斌, 瞿伟菁, 张晓玲. 芹菜素的药理作用研究进展[J]. 中药材, 2004, 27(7): 531-534.

[6]宋小俊, 王怡婷. 芹菜药用功能研究概述[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(15): 6360-6361; 6395.

[7]黄菲, 罗曼. MTT比色法在抗肿瘤香精油筛选中的应用[J]. 食品科学, 2009, 30(1): 75-79.

[8]吕丽爽, 黄健花, 周庆, 等. 芦蒿中黄酮类化合物提取工艺研究[J].食品工业科技, 2002, 23(9): 48-49.

[9]张德权, 台建祥, 付勤. 生物类黄酮的研究及应用概况[J]. 食品与发酵工业, 1999, 25(6): 52-57.

[10]杜崇民, 刘春宇. 黄酮类化合物抗肿瘤研究进展[J]. 中国野生植物资源, 2007, 26(3): 4-7.

[11]BIRT D F, HENDRICH S, WANG W. Dietary agents in cancer prevention: flavonoids and isoflavonoids[J]. Pharmacology and Therapeutics, 2001, 90(2/3): 157-177.

[12]PLOCHMANN K., KORTE G, KOUTSILIERI E, et al. Structure-activity relationships of flavonoid-induced cytotoxicity on human leukemia cells[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2007, 46(1): 1-9.

[13]BURDA S, OLESZEK W. Antioxidant and antiradical activities of flavonoids[J]. Journal of Agricultrual and Food Chemistry, 2001, 49(6): 2774-2779.

[14]KO W G, KANG T H, LEE S J, et al. Effects of luteolin on the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in human myeloid leukaemia cells[J]. Phytotherapy Research, 2002, 16(3): 295-298.

[15]LI Y, SARKAR F H. Inhibition of nuclear factor κ B Activation in PC3 cells by genistein is mediated via Akt signaling pathway[J]. Clinical Caner Research, 2002, 8(7): 2369-2377.

Optimization of Total Flavonoids Extraction from the Leaves of Adinandra nitida and Their Inhibitory Effect on Lung Cancer A549 Cells

ZHAN Yu，ZENG Qing-zhu，FANG Ling
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China)

Adinandra nitida is a traditional Chinese herb for health drink, of which leaves are rich in flavonoids. The optimization of total flavonoids extraction from the leaves of Adinandra nitida with ethanol as the extraction solvent was conducted in this work, which was also aimed at examining if the total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida have the ability to inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells. The optimal extraction conditions of total flavonoids from Adinandra nitida leaves were determined by response surface methodology to be: extraction time, 10 min; ethanol concentration, 63%, extraction temperature, 70 ℃; and material/liquid ratio, 1:20. The extraction rate of total flavonoids was (95.58 ± 0.49) % under the optimal extraction conditions. The inhibitory effect of the total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida on the proliferation of lung cancer A549 cells was evaluated by MTT assay. The total flavonoids could significantly inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells in significant time-dependent and dose-dependent manners.

Adinandra nitida；total flavonoids；extraction condition；physiological function

TQ91

A

1002-6630(2010)22-0006-05

2010-01-17

广州市科技局项目(2006J1-C0251)；广州大学食品加工与安全重点实验室资助项目(2010)

战宇(1974—)，女，讲师，博士，主要从事天然产物及其开发研究。E-mail：yuzhan@scut.edu.cn