古丽巴哈尔·阿巴拜克力

(新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054)

新疆粉绿铁线莲不同部位总黄酮的抗氧化活性

古丽巴哈尔·阿巴拜克力

(新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054)

采用有机溶剂提取新疆粉绿铁线莲植物总黄酮，测定总黄酮提取液的还原力、抗氧化能力。以VC作对照，不同部位还原力强弱为：VC＞粉绿铁线莲叶＞粉绿铁线莲花＞粉绿铁线莲果实＞粉绿铁线莲茎。对于羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力粉绿铁线莲叶优于其他3个部位，对于DPPH自由基的清除率大小依次为粉绿铁线莲果实 ＞粉绿铁线莲花＞粉绿铁线莲叶＞粉绿铁线莲茎。因此，粉绿铁线莲总黄酮具有一定的抗氧化能力，值得深入研究其生理功能以开发相应的功能产品。

粉绿铁线莲；总黄酮；还原力；抗氧化

粉绿铁线莲(Clematis glauca Willd.)藤本，生于山地灌丛，海拔1700～2500米，平原河漫滩城郊田间及荒地。分布于我国新疆、青海、甘肃、陕西、山西。国外在蒙古、西伯利亚及中亚地区也有分布。全草可以入药，可祛风湿，主治慢性风湿性关节炎，关节疼痛；熬膏外敷可以治疗疮；枝叶水煎外洗，可止瘙痒症[1]。

自由基是具有不成对电子的原子或分子，其性质不稳定，大多富于反应活性。近年来，研究自由基及其抑制剂、清除剂和动力学机制逐渐成为化学及医学中的一个新的研究方向，受到人们越来越大的关注，并取得不少研究成果[2-3]。目前，国内外有关于粉绿铁线莲的报道不多，多集中在其挥发油、黄酮类化合物提取方面[4]，本实验研究新疆地产药用植物粉绿铁线莲不同部位中黄酮类化合物的抗氧化活性，旨在为开发和利用其有效成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粉绿铁线莲采自新疆乌鲁木齐县永丰乡农田田埂等地。

芦丁对照品、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醚、无水乙醇、三氯化铁、过氧化氢、硫酸亚铁、水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、DPPH(1,1二苯基苦味酰基苯肼)、VC等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

粉碎机、2800UV-VIS扫描型紫外可见分光光度计

上海尤尼柯仪器有限公司；PL-IC电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-9141A型电热恒温干燥箱、SHZ-D循环水式真空泵、HH-S电热恒温水浴锅、RE-52A旋转蒸发器。

1.3 黄酮的测定

1.3.1 试剂制备

体积分数4%过氧化氢水溶液、pH6.8磷酸缓冲液、pH8.2 Tris-HCl缓冲液[5]。

1.3.2 对照品溶液的制备[6]

准确称取芦丁对照品(120℃干燥至恒质量)0.0200g，加30%乙醇溶解，定容到100mL容量瓶中，摇匀。

1.3.3 标准曲线的绘制

准确吸取0.200mg/mL的芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置于25mL容量瓶中，各加5g/100mL亚硝酸钠水溶液1.0mL，混匀，放置6min；加10g/100mL硝酸铝水溶液1.0mL，混匀，放置6min；加4g/100mL氢氧化钠10mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15min。按照分光光度法在510nm波长处，以试剂空白作参比测定吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 粉绿铁线莲不同部位中总黄酮的提取[7-8]

铁线莲样品不同部位样品自然风干，然后粉碎成末。分别准确称取一定量的不同部位粉末，置于索氏提取器中，乙醚于45℃水浴回流脱脂。直到醚层无色为止，弃醚层，挥干乙醚，按料液比1:40的比例用70%乙醇于70℃水浴中连续提取2h，趁热过滤。同样的方法提取两次，合并两次提取液。用70%乙醇洗涤样品粉末(10mL×2)，过滤，将提取液和洗液合并，浓缩提取液。用30%乙醇定容于100mL容量瓶中，备用。

1.3.5 测定方法

分别量取不同部位样品液0.4mL，于25mL容量瓶中，按照标准曲线制备项中的方法进行操作，于510nm波长处测定吸光度。

1.3.6 总黄酮含量计算公式

总黄酮含量/(mg/mL)=稀释倍数×c

式中：c为测定样品液中芦丁的含量/(mg/mL)；稀释倍数=100mL/0.4mL=62.5；重复测定4次，取其平均值。

1.4 还原力的测定

分别准确吸取2.0mL不同质量浓度的不同部位样品液、VC溶液，加入0.2mol/L pH6.8磷酸缓冲液2.0mL，1%铁氰化钾2.0mL，50℃水浴20min后急速冷却，加入10g/100mL三氯乙酸水溶液2.0mL，于3000r/min离心10min，取上清液5.0mL，加蒸馏水4.0mL、0.1%三氯化铁1.0mL，混合10min后以蒸馏水作参比于700nm波长处测定吸光度。

1.5 抗氧化性能测定

1.5.1 测定粉绿铁线莲不同部位总黄酮对羟自由基的清除率[9]

式中：A0为空白对照溶液吸光度；Ax为样品液吸光度；Ax0不加H2O2样品液的本底吸光度。

1.5.2 测定不同部位总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率[10]

式中：A空为空白管吸光度；A样为样品液吸光度。

1.5.3 测定不同部位总黄酮对DPPH自由基的清除率[11]

式中：Ac为2.0mL(0.04mg/mL)DPPH＋2.0mL 95%乙醇溶液的吸光度；AI为2.0mL(0.04mg/mL)DPPH＋2.0mL样品液的 吸光度；AJ为2.0mL(0.04mg/mL)样品＋ 2.0mL95%乙醇溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线回归方程的建立

用最小二乘法经线性回归，得回归方程：y = 0.0968x-0.0224，相关系数R2= 0.9996，表明芦丁浓度与吸光度有良好的线性关系。

2.2 粉绿铁线莲不同部位总黄酮的含量测定结果

表1 粉绿铁线莲不同部位总黄酮的含量(±s，n=4)Table 1 Total flavonoid contents of different organs ofClematis glaucaWilld. (±s，n=4)

表1 粉绿铁线莲不同部位总黄酮的含量(±s，n=4)Table 1 Total flavonoid contents of different organs ofClematis glaucaWilld. (±s，n=4)

部位茎叶花果实总黄酮含量/(mg/mL)2.766±0.0936 8.5315±0.0806 3.4535±0.3402 2.8285±0.1645

由表2可知，粉绿铁线莲不同部位总黄酮含量有一定的差别，总黄酮含量依次为粉绿铁线莲叶＞花＞果实＞茎。不同质量浓度样品液的制备用30%乙醇稀释即得。

2.3 粉绿铁线莲还原力测定结果

由图1可知，可以看到4个部位光密度都随总黄酮质量浓度的增大逐渐增加。经SPSS分析，粉绿铁线莲不同部位总黄酮的还原力与质量浓度呈线性相关，其回归方程分别为：VC：y=0.2299x+0.7333(R2= 0.9818)；叶：y = 0.1195x + 0.1773(R2= 0.9051)；果实：y = 0.0518x +

0.1386(R2= 0.8318)；花：y= 0.0842x + 0.1432(R2=0.9234)；茎：y=0.040x+ 0.1094(R2= 0.7283)。不同部位总黄酮的还原力都随着质量浓度浓度的增大而增强，其还原能力大小是：VC＞粉绿铁线莲叶＞粉绿铁线莲花＞粉绿铁线莲果实＞粉绿铁线莲茎。光密度越大则还原力越强。总体来看粉绿铁线莲叶的还原力要强于粉绿铁线莲果实、花、茎。

图1 粉绿铁线莲不同抗氧化剂的还原力Fig.1 Concentration dependent curves of reducing power of different organs ofClematis glaucaWilld. and VC

2.4 粉绿铁线莲对·OH清除率的测定结果

图2 粉绿铁线莲清除·OH活性的量效关系Fig.2 Concentration dependent curves of hydroxyl free radical scavenging capacity of different organs ofClematis glaucaWilld. and VC

由图2可知，各样品对清除·OH均有较好的量效关系。在200～1000μg/mL范围内经SPSS分析，粉绿铁线莲不同部位样品液及VC的曲线方程分别为：VC：y=13.173x+23.439(R2=0.9932)；叶：y=5.06x+10.01(R2= 0.8836)；果实：y=4.670x+9.294(R2=0.8750)；花：y= 4.226x+7.634(R2=0.9646)；茎：y=3.774x+6.366(R2= 0.9797)。样品液质量浓度200μg/mL时茎、叶、果实总黄酮对·OH的清除率较接近。叶样品液质量浓度在600～1000μg/mL时总黄酮对·OH的清除效率较高。

果实样品液总黄酮对·OH的清除率在样品质量浓度200～400μg/mL时随质量浓度的变化增加明显，随后增加幅度不明显。茎、花等样品液总黄酮对·OH的清除率样品液在质量浓度200～1000μg/mL随质量浓度的增大变化不明显。比较各个部位对·OH清除能力的最高值大小为： VC＞粉绿铁线莲叶＞粉绿铁线莲果实＞粉绿铁线莲花＞粉绿铁线莲茎。

2.5 粉绿铁线莲对O2·清除作用的测定结果

图3 粉绿铁线莲清除O2·活性的量效关系Fig.3 Concentration dependent curves of superoxide anion free radical scavenging capacity of different organs ofClematis glaucaWilld. and VC

由图3可知，各样品对O2·的清除作用都随质量浓度的增大而有不同程度的增强，经SPSS分析，粉绿铁线莲不同部位样品液及VC的曲线方程分别为：VC：y=12.878x-1.158(R2=0.9888)；叶：y=6.654x-0.50(R2= 0.7091)；果实：y=5.992x+5.63(R2=0.9827)；花：y= 3.424x+0.42(R2=0.9961)；茎：y=6.779x-5.905(R2= 0.9884)。VC对O2·的清除率随质量浓度的增加显著增强，茎样品液总黄酮对O2·的清除率随着样品液质量浓度增加而缓慢增长。果实样品液质量浓度200～600μg/mL时清除率上升较快，在600～800μg/mL时清除率变化不明显，超过 800μg/mL后清除率变化明显。花样品液在浓度200～1000μg/mL时清除率变化较缓慢。叶样品液对该自由基清除率随着质量浓度变化在200～800μg/mL时增加不明显，但超过 800μg/mL后增加明显。各部分对O2·的清除能力的最高值大小为：VC＞粉绿铁线莲叶＞粉绿铁线莲果实＞粉绿铁线莲茎＞粉绿铁线莲花。

2.6 粉绿铁线莲对DPPH自由基清除率的测定结果

图4 粉绿铁线莲清除DPPH自由基活性的量效关系Fig.4 Concentration dependent curves of DPPH free radical scavenging capacity of different organs ofClematis glaucaWilld. and VC

由图4可知，经SPSS分析，粉绿铁线莲不同部位样品液及VC的曲线方程分别为：VC：y=12.606x+22.606 (R2=0.9268)；叶：y=2.519x+10.477(R2=0.9961)；果实：

y=1.672x+20.36(R2=0.9272)；花：y=1.453x+17.803(R2= 0.95.3)；茎：y=1.935x+9.617(R2=0.9373)。不同部位自由基清除率随着样品液质量浓度增加而增加但不明显，样品液质量浓度200μg/mL时茎和叶的DPPH自由基清除能力相近，样品液质量浓度600μg/mL时茎、花、叶、果实对DPPH自由基清除能力相近。但可以明显的看出果实和花对DPPH自由基清除能力大于茎和叶的清除率。总的来看，不同部位对DPPH自由基清除能力的大小顺序为：VC ＞粉绿铁线莲果实 ＞粉绿铁线莲花＞粉绿铁线莲叶＞粉绿铁线莲茎。

3 结 论

粉绿铁线莲不同部位总黄酮具有较强的还原力，随着样品质量浓度的增加，还原力也增加，5种待测样品的还原力强弱为：VC＞粉绿铁线莲叶＞粉绿铁线莲花＞粉绿铁线果实＞粉绿铁线莲茎。

实验证明，粉绿铁线莲不同部位总黄酮具有很强的清除自由基的能力。在高质量浓度时(1000μg/mL)叶对·OH的清除率高于其他3个部位，而茎、叶、花相差不大；在1000μg/mL是叶对O2·清除率也明显高于其他3个部位，而其他3个部位的清除能能力依次为果实＞茎＞花；对DPPH自由基的清除率为粉绿铁线莲果实＞花＞叶＞茎。

总体看来，粉绿铁线莲总黄酮具有很强的还原能力和自由基清除活性，通过本研究可知粉绿铁线莲具有较好的医学价值。

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Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Different Organs of Clematis glauca Willd. in Xinjiang

Gulibahaer ABABAIKELI
(College of Life Science, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China)

The organic solvent extraction of different organs of Clematis glauca Willd. in Xinjiang was performed for obtaining total flavonoids, and the extract obtained was tested for its reducing power and its abilities to scavenge hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals using VC as the control. The order of reducing power of different organs of Clematis glauca Willd and VC from strong to weak was VC ＞ leaf ＞ flower ＞ fruit ＞ stem. The leaves of Clematis glauca Willd. was superior to the other three organs of the plant in hydroxyl and superoxide anion free radical scavenging capacities. As for the ability to scavenge DPPH free radicals, the four organs of the plant were ranked as follows: fruit ＞ flower ＞ leaf ＞ stem. In a word, the total falavonoids from Clematis glauca Willd. have some antioxidant activity and thus, deserve to be developed as functional products based on in-depth studies of their physiological functions.

Clematis glauca Willd.；total flavonoid；reducing power；antioxidant activity

Q946.8

A

1002-6630(2010)23-0018-04

2010-08-18

新疆濒危物种保护生物学重点实验室资助项目

古丽巴哈尔·阿巴拜克力(1969—)，女，副教授，硕士，研究方向为植物有效成分分析。E-mail：gvlbahar.a@163.com