张文芹，许文清，孙 怡，叶 红，曾晓雄*

(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)

苦丁茶冬青与大叶冬青苦丁茶提取物体外抗氧化活性比较研究

张文芹，许文清，孙 怡，叶 红，曾晓雄*

(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)

比较苦丁茶冬青苦丁茶和大叶冬青苦丁茶提取液中多酚、黄酮的含量及体外抗氧化能力，结果表明：多酚含量高的苦丁茶冬青苦丁茶比黄酮含量高的大叶冬青苦丁茶具有较高的体外抗氧化能力；对5种体外抗氧化活性评价方法之间的相关性进行分析，表明各抗氧化方法间相关性良好(R2＞0.8478)，尤以DPPH自由基法与ABTS＋·法的相关性最高(R2=0.9967)。

苦丁茶冬青苦丁茶；大叶冬青苦丁茶；多酚；黄酮；抗氧化

苦丁茶是我国南部和东部地区人民饮用的一种代用茶，富含多酚、黄酮、皂素、氨基酸等多种活性物质，具有散风热、清头目、生津止渴、消食提神、消炎、杀菌、止痒、减肥、降血压等多种药理功能[1-4]。有关苦丁茶的原植物一直存在争议，现已报道有31种植物在不同地区被称为苦丁茶[5]，其中最主要的3种为冬青科的苦丁茶冬青(Ilex kudingeha CJ Tseng)、大叶冬青(Ilex latifolia Thunb)和枸骨(Ilex cornuta Lindl. Ex Paxt.)[6-7]，并主产于海南、广东、广西、湖南、浙江等省。

多酚类化合物是高等植物中普遍存在的次级代谢产物，具有广泛的生物活性。但是，有关苦丁茶多酚含量以及抗氧化活性的研究较少[8]。实验以苦丁茶冬青树叶加工而成的苦丁茶为原料，采用Folin-Ciocalteu比色法测定苦丁茶粗提物和各萃取物的多酚含量，并应用DPPH自由基法、TEAC法和FRAP法测定粗提物和各萃取物的抗氧化活性，结果表明苦丁茶提取物具有较高的多酚含量和较强的抗氧化能力。在此基础上，拟通过测定大叶冬青苦丁茶与苦丁茶冬青苦丁茶的多酚与黄酮含量、自由基清除能力(包括清除D P P H自由基、ABTS+·和·OH)及还原Fe3+为Fe2+的能力，比较两种苦丁茶的抗氧化活性，旨在为苦丁茶的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦丁冬青苦丁茶(海南) 海南椰仙生物科技有限公司；

大叶冬青苦丁茶(浙江) 浙江大学茶业科技开发公司。

Folin-Ciocalteu试剂、绿原酸(CHA)、DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 和ABTS (2,2-azino-bis-(3-ethylbenothiazolin-6-sulfonate) 美国Sigma公司；TPTZ (2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-trizaine) Fluka公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SHZ-88型往复水浴恒温振荡器、HH-4数显恒温水浴锅 江苏国华电器有限公司；冷冻干燥机 美国Labconco公司；722S可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；BL-220H分析天平 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 苦丁茶粗提物的制备

准确称取粉碎过筛的苦丁茶样，用沸水以料液1:10 (m/V)比于95℃水浴中提取30min，5000×g离心10min，取上清液，剩余残渣重复以上操作，合并上清液，经浓缩、冷冻干燥得苦丁茶粗提物。称取一定量粗提物，用水溶解，即为分析用样品液。

1.3.2 多酚含量的测定

多酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法[9]。取0.5mL样品液(适当稀释)与1.0mL Folin-Ciocalteu试剂混匀，静置5min，加入2.0mL饱和Na2CO3溶液，30℃水浴反应1h，冷却，测定747nm波长处吸光度。样品中多酚含量以CHA(绿原酸)当量表示。

1.3.3 黄酮含量的测定

黄酮含量的测定采用AlCl3法[10]。称取5mg芦丁加入10mL 30%乙醇，配成0.5mg/mL的母液，依次稀释成质量浓度为0.1、0.08、0.05、0.04、0.02mg/mL的标准液, 测定430nm波长处吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。

取1.0mL样品液(适当稀释)与1mL 30g/100mL AlCl3乙醇溶液混匀，室温反应10min，测定430nm波长处吸光度。样品中黄酮含量以芦丁的当量表示。

1.3.4 抗氧化能力评价

1.3.4.1 ABTS+·清除能力的测定

参照Stratil等[11]的方法(TEAC法)。取3.9mL ABTS+·溶液与0.1mL样品液混合、摇匀，37℃水浴反应并计时，以磷酸盐缓冲液调零，测定反应液在第10min时734nm波长处的吸光度(Ai)，同时测定3.9mL ABTS+·溶液与0.1mL的磷酸盐缓冲液的吸光度(Ac)和3.9mL的磷酸盐缓冲液与0.1 mL的样品液的吸光度(Aj)。样品对ABTS+·的清除率按照式(1)计算。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照Leong等[12]的方法。将DPPH自由基的无水乙醇溶液3mL1×10-4mol/L与0.1mL不同质量浓度的样品溶液混合，摇匀，室温、暗室反应30min。以无水乙醇调零，测517nm波长处吸光度(A1)，同时测定0.1mL样液与3.0mL无水乙醇混合液的吸光度(A2)和0.1mL无水乙醇与3.0mL DPPH自由基醇溶液混合液的吸光度(A0)。样品对DPPH自由基的清除率按照式(2)计算。

1.3.4.3 ·OH清除能力的测定

参照曾晓玲[13]、金鸣等[14]的方法。依次加入2.0mL 0.15mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)、1.0mL 7.5×10mol/L邻二氮菲、1.0mL 7.5×10mol/L FeSO4、1.0mL样品液，立即混匀后，加入1.0mL 0.01% H2O2，混匀，37℃水浴反应60min，测定536nm波长处的吸光度(A样)。以1.0mL的蒸馏水代替样品液，迅速混匀后加入1.0mL 0.01% H2O2，待反应结束测其吸光度(A损)。以2.0mL的蒸馏水代替样品液与0.01% H2O2，迅速混匀，待反应结束测其吸光度(A未损)。样品对·OH清除能力按照式(3)计算。

1.3.4.4 还原能力的测定

方法1：参照Benzie等[15]的方法(FRAP法)。取0.2mL样品溶液加入3.0mL FRAP试剂(由300mmol/L醋酸盐缓冲液300mL、10 mmol/L TPTZ溶液30mL、20mmol/L FeCl3·6H2O溶液30mL组成)，混匀后37℃反应10min，测定593nm波长处吸光度的变化，以1mmol/L FeSO4为对照。样品抗氧化能力(FRAP值)以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示。

方法2：参考Oyaizu[16]的方法。取0.4mL样品液(适当稀释)，加入0.4mL 0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.6) 及0.4mL 1g/100mL K3Fe(CN)6，混合均匀，于50℃下反应20min ，再加入0.4mL 的10 g/100mL三氯乙酸，混合后5000×g离心10min。取上清液1.0mL，加入1.0mL蒸馏水和0.2mL 0.1g/100mL的三氯化铁溶液，混合均匀，室温下反应10min，测定其700nm波长处的吸光度。实验以抗坏血酸为对照。

2 结果与分析

2.1 大叶冬青苦丁茶与苦丁茶冬青苦丁茶的多酚与黄酮含量

苦丁茶冬青苦丁茶、大叶冬青苦丁茶提取液的多酚含量分别为131.91、120.93mg绿原酸/g(以干质量计)，

黄酮含量分别为13.91、16.74mg芦丁/g(以干质量计)。苦丁茶冬青苦丁茶与大叶冬青苦丁茶多酚及黄酮含量有明显的差别，苦丁茶冬青苦丁茶多酚含量高于大叶冬青苦丁茶，而黄酮含量却低于大叶冬青苦丁茶。

2.2 大叶冬青苦丁茶与苦丁茶冬青苦丁茶的抗氧化能力分析

图1 大叶冬青苦丁茶与苦丁冬青苦丁茶的清除自由基能力的比较Fig.1 Comparisons of scavenging activities of kudingchas made from Ilex latifolia Thunb and Ilex kudingcha C.J. Tseng

2.2.1 ABTS+·的清除能力

TEAC法常被用于总抗氧化能力的测定[17-18]。利用该法测定大叶冬青苦丁茶与苦丁茶冬青苦丁茶提取液的抗氧化能力，结果发现苦丁茶冬青苦丁茶提取液的清除能力比大叶冬青苦丁茶提取液的稍强(图1A)，苦丁茶冬青苦丁茶提取液的IC50(清除率达50%时所需要的浓度)为124.3μg/mL，大叶冬青苦丁茶提取液的IC50为133.1μg/mL (表1)。IC50越低，样品的抗氧化能力越强，这也说明苦丁茶冬青苦丁茶提取液的清除能力比大叶冬青苦丁茶提取液的稍强。

2.2.2 DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一种合成的有机自由基，常用来研究酚类抗氧化剂的构效关系，是近年来受到国内外普遍重视的一种分析抗氧化活性的方法[19-21]。由图1B可知，苦丁茶冬青苦丁茶对DPPH自由基的清除率高于大叶冬青苦丁茶。提取液的IC50值见表1，苦丁冬青苦丁茶提取液的IC50为234.6μg/mL，大叶冬青苦丁茶提取液的IC50为262.1μg/mL。

2.2.3 ·OH的清除能力

·OH被公认是生物系统中最具活性的活性氧，能导致生物体内DNA、蛋白质和脂质氧化损伤。两种苦丁茶提取液的IC50见表1，苦丁茶冬青苦丁茶提取液的IC50为32.8μg/mL，大叶冬青苦丁茶提取液的IC50为56.1μg/mL。由图1C可知，苦丁茶冬青苦丁茶对·OH的清除能力高于大叶冬青苦丁茶。

2.2.4 还原能力

FRAP法的原理是基于具有抗氧化活性的物质将Fe3+还原成Fe2+的能力，因Fe2+与TPTZ反应呈现出明显的蓝色，并在593nm波长处有最大吸收峰[23]，通过吸光度的大小判断待测物抗氧化能力的强弱。研究结果表明苦丁茶冬青苦丁茶提取液与大叶冬青苦丁茶提取液的FRAP值分别为4.95、4.88mmol FeSO4/g(以干质量计)，两者没有明显差异(表1)。

表1 苦丁茶粗提物的抗氧化能力测定结果Table 1 Antioxidant activities of crude extract of kudingcha

此外本研究还利用Fe3+-Fe2+氧化还原体系测定苦丁茶粗提取物的还原能力，该方法可以评估试样是否为良好的电子供体[24]。Fe3+被抗氧化物质还原成为Fe2+，吸光度越大，表明还原能力越强。结果如表1所示，苦丁茶冬青苦丁茶的还原能力为207.2mgVC/g，而大叶冬青苦丁茶的为162.9mgVC/g。由此可见苦丁茶冬青苦丁茶还原力大于大叶冬青苦丁茶，表明苦丁茶冬青苦丁茶具有更好的抗氧化能力。

通过应用5种方法综合测定大叶冬青苦丁茶及苦丁茶冬青苦丁茶的体外抗氧化能力，结果表明(表1)，苦丁茶冬青苦丁茶体外抗氧化能力各指标均高于大叶冬青苦丁茶，说明苦丁茶冬青苦丁茶既有较高的自由基清除能力又有较强的还原Fe3+成为Fe2+能力。

2.3 相关性分析

2.3.1 多酚和黄酮含量与各抗氧化方法的相关性分析

表2 相关性分析Table 2 Analysis of correlation coefficients

通过对多酚含量和黄酮含量与各抗氧化性评价方法的相关性分析可以得出多酚与各方法的相关性较黄酮高(表2)。由此推测多酚可能是苦丁茶中主要的抗氧化成分，抗氧化能力与多酚含量具有相同的趋势，这与之前的报道结果一致[8,25]。通过比较各相关性因子可以看出苦丁茶冬青苦丁茶中多酚含量与D P P H自由基、ABTS+·以及·OH清除能力的相关性明显高于大叶冬青苦丁茶，而铁离子还原抗氧化剂能力与总还原力则是与大叶冬青苦丁茶中多酚含量的相关性较高。DPPH自由基清除能力、铁离子还原抗氧化剂能力以及总还原力与大叶冬青苦丁茶中黄酮含量的相关性比苦丁茶冬青苦丁茶高，而ABTS+·、·OH清除能力与大叶冬青苦丁茶黄酮含量的相关性比苦丁茶冬青苦丁茶低。

2.3.2 抗氧化评价方法之间相关性分析

通过对各抗氧化评价方法进行两两相关性分析可以得出各种评价方法在本实验中相关性均较好(R2＞0.8478)。由表2可以看出，苦丁茶冬青苦丁茶中相关性最高的两种方法为FRAP法与DPPH自由基法，相关性因子R2为0.9780；相关性最低的两种方法为总还原力测定法与·OH清除能力测定法，相关因子R2为0.8832。大叶冬青苦丁茶中相关性最高的两种方法为TEAC法与DPPH法，相关性因子R2为0.9967；相关性最低的两种方法为总还原力测定法与·OH清除能力测定法，相关因子R2为0.8478。因此，无论是苦丁茶冬青苦丁茶还是大叶冬青苦丁茶，相关性最低的两种方法均是总还原力测定与·OH清除能力测定法，这可能与两种方法的测定原理有关。

实验结果表明抗氧化活性较高的样品同时含有较高的多酚含量，由此可以初步判定多酚为苦丁茶提取液抗氧化能力的主要物质来源。而且综合各种抗氧化方法及相关性可以看出，苦丁茶冬青苦丁茶的抗氧化性比大叶冬青苦丁茶的抗氧化性强，这可能与苦丁茶冬青苦丁茶中多酚含量高相关。

本实验对于苦丁茶水提取液的抗氧化能力评价采用了两套不同的评价体系。评价体系之一为评价样品对自由基的清除能力，在这一评价体系中选用了对DPPH自由基、ABTS+·及·OH的清除能力作为评价方法。评价体系之二为评价样品的还原能力，采用测定铁离子还原抗氧化剂的能力、总还原力两种不同的测定方法。之所以选用两种不同的评价体系是因为这两套不同的体系可以共同并较为准确的反映样品的抗氧化能力。在不同的体系内部选用不同的方法主要是为了弥补单种独立评价方法的不足，以防方法的局限性导致实验数据的片面性。由分析结果来看体系内部各方法之间相关性非常显著，而自由基清除能力评价体系与还原能力评价体系两体系之间相关性相对较低。研究结果充分说明了选取不同体系对样品抗氧化能力同时进行评价的必要性。

3 结 论

本研究比较苦丁茶冬青苦丁茶和大叶冬青苦丁茶提取液中多酚、黄酮的含量及体外抗氧化能力，结果表明两种苦丁茶均具有较好的体外抗氧化活性；相对而言，多酚含量高的苦丁茶冬青苦丁茶比黄酮含量高的大叶冬青苦丁茶具有较高的体外抗氧化能力。因此，富含多酚类物质和良好抗氧化活性的苦丁茶冬青苦丁茶和大叶冬青苦丁茶具有广阔的开发应用前景。

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Comparative Evaluation of Antioxidant Activity in vitro of Aqueous Extracts from Ilex kudingcha C.J. Tseng and Ilex latifolia Thunb Leaf Teas

ZHANG Wen-qin，XU Wen-qing，SUN Yi，YE Hong，ZENG Xiao-xiong*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The contents of polyphenols and flavonoids and the antioxidant activities in vitro of aqueous extracts from the leaf teas of Ilex latifolia Thunb and Ilex kudingcha C.J. Tseng were determined. It was found that the aqueous extract from Ilex kudingcha C.J. Tseng had both higher polyphenol content and in vitro antixodiant performance than that from Ilex latifolia Thunb. The correlation analysis among five antioxidant evaluation methods in vitro demonstrated that there was a good correlation among them (R2＞0.8478), and the correlation between DPPH and ABTS+free radical scavenging assays was the most significant (R2= 0.9967).

Ilex kudingcha C.J. Tseng leaf tea；Ilex latifolia Thunb leaf tea；polyphenol；flavonoid；antioxidant activit

Q946.84

A

1002-6630(2010)23-0022-05

2010-05-20

国家“863”计划项目(2007AA10Z351)；南京农业大学高层次人才引进基金项目(804066)

张文芹(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：Zhangwenqin51@163.com

*通信作者：曾晓雄(1964—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：zengxx@njau.edu.cn