徐汉福 幸俊逸 王职峰 夏庆友

(西南大学蚕学与系统生物学研究所,生物技术学院,重庆 400716)

来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的piggyBac转座子,以其高效的转座发生频率、准确的插入和切出以及几乎不受物种局限等优点,成为包括果蝇、按蚊等昆虫和小鼠、人等哺乳动物在内的许多生物种转基因研究常用的转座介导工具。目前,研究人员基于piggy-Bac转座系统,已经建立了插入诱变、基因和蛋白诱捕、增强子和启动子诱捕等遗传分析工具,显示出其在基因功能研究中的巨大潜力。

就家蚕转基因而言,尽管研究人员曾进行了大量探索,但由于过去未找到类似于果蝇P因子的有效介导工具,转基因蚕的研究一直未能取得突破。直至2000年,Tamura等尝试利用piggyBac转座子为介导,经显微注射家蚕早期胚胎成功获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的转基因蚕[1]。这种方法后几经改进,已成为获得转基因蚕最为有效和主要的方法,有关家蚕转基因的研究也自此进入了快速发展阶段。目前,包括本实验室在内,国内外已有近10家研究机构建立了以piggyBac为介导的家蚕转基因技术,并基于此建立了GAL4/UAS[2]、热激诱导[3,4]、启动子诱捕[5]和增强子诱捕[6]等工具,研究了保幼激素酯酶(J HE)[7]、双性基因(Bmdsx)[8]、类胡萝卜素结合蛋白(CPB)[9]、犬尿氨酸3-单氧酶(KMO)[10]和蜕皮触发激素(ET H)[11]等家蚕基因的功能。同时,还开展了家蚕生物反应器、茧丝改性和转基因抗病育种等应用基础研究,获得了一批有用蛋白生产、有色茧和抗核型多角体病毒(BmNPV)的转基因素材。但总的来说,目前的家蚕转基因研究中,对piggyBac的研究利用仍集中在基因功能解析和生物反应器开发等方面,而对其本身的一些特性,如piggyBac的基因组整合位点、转座后的稳定性等,尚无系统的研究报道。因此,本论文将着重通过分析外源piggyBac转座元件在转基因家蚕中的基因组整合位点,研究其插入整合特征,以期为更好的利用piggyBac转座子开展家蚕转基因研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据来源与分析方法

本研究采用的有效样本数据共67个,包括本次实验获得的23个结果和已发表的44个结果[1,4,7,10,12-16]。外源piggyBac整合位点区域的内含子、外显子和非翻译区等分析基于家蚕基因组数据库SilkDB(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)中预测的基因序列及其结构进行逐一比对确认;整合位点上下游区域分析策略如下:以piggyBac特征性识别位点T TAA为起点,提取其上下游各5bp或10Kb的序列,然后采用本地Blast程序分别在NCBI和SilkDB库中进行批量比对,并结合手工方法加以确认;染色体定位采用Silkmap(http://silkworm.swu.edu.cn/silksoft/silkmap.html)。

1.2 材料来源与实验方法

实验材料来自于本研究组建立的23个独立的家蚕转基因品系。采用如下方法:

基因组DNA提取:参照Tamura等报道的方法[1],提取G1代转基因蚕(蛹或蛾)基因组DNA,加ddH2O调整至终浓度100ng/μ L。

基因组DNA酶切与连接环化:分别取基因组DNA10μ g,加HaeIII内切酶2μ L于50μ L体系中酶切过夜,经65℃处理15min,用2倍体积无水乙醇于-20℃条件下沉淀20min后采用12000rmp离心15min,去上清沉淀溶于20μ L ddH2O;取上述处理后的酶切产物5μ L,加T4 DNA连接酶1μ L于50μ L体系中连接过夜;连接反应结束后,加2倍体积无水乙醇至连接产物,于-20℃条件下沉淀20min,后采用12000rmp离心15min,去上清沉淀溶于20μ L ddH2O。

Inverse PCR反应:所用引物由上海生工合成,包括piggyBac左臂引物pBacL_F:5'-ATCAGTGACACT TACCGCATTGACA-3'和pBacL_R:5'-TGACGAGCT TGT TGGTGAGGAT TCT-3',右臂引物pBacR_F:5'-TACGCATGAT TATCTT TAACGTA-3'和pBacR_R:5'-GGGGTCCGTCAAAACAAAACATC-3'。PCR反应体系:基因组DNA酶切环化产物2μ L,10×PCR缓冲液2.5μ L,2mmol/L dNT P 2μ L,0.2μ mol/L正反向引物各0.3μ L,EX Taq DNA聚合酶0.3μ L,加ddH2O补至终体积25μ L。PCR反应条件:95℃预变性5 min,(95℃30 sec,58℃45 sec,72℃1min)×30个循环,72℃10min,4℃保存。

PCR产物克隆与测序:采用全式金试剂盒对上述PCR扩增产物进行纯化或克隆至pMD19-T simple载体后送公司测序。

2 结果与分析

2.1 piggyBac转座元件在转基因家蚕中的整合位点

对本次实验获得的23个和已发表的44个共计67个有效的piggyBac整合位点进行Blast比对分析,结果显示:上述序列均能在家蚕基因组数据库中检索到匹配序列,但仅有50个位点序列(编号为IS-1～IS-50)能确定其在基因组中的具体位置,其中的46个可定位至家蚕的18条染色体,但在染色体上的分布并无规律(图1)。另外的27个位点序列因检索到的匹配序列过多,尚难确定其具体位置。

图1 外源piggyBac转座元件家蚕染色体上的定位

2.2 piggyBac转座元件在基因内部区域的分布概况

基于IS-1～IS-50位点数据,采用Blast等程序分析piggyBac转座元件在基因内部区域的插入整合特征,结果显示:有6个整合位点位于内含子区域(占12%),10个位于5'端调控区域(占20%),6个位于3'端调控区域(占12%),而在外显子区域没有检测到piggyBac的插入(图2);另外的28个整合位点位于基因间区。该结果初步说明,在家蚕中,外源piggyBac转座能够较容易的整合至家蚕基因的内部区域。至于在外显子中无piggyBac的插入,推测其中既有可供分析的样本量还不够丰富的原因;另一方面,由于外源转座子的随机插入可能会对宿主造成潜在的有害影响,如插入突变干扰基因功能或调节、转录/翻译造成宿主能量消耗、异位重组导致基因突变等,故宿主往往启用自身防御机制以防止因外源转座子的突然插入而导致基因功能异常或缺失等潜在风险。

图2 外源piggyBac转座元件家蚕基因内部区域的分布

2.3 piggyBac转座元件整合位点两侧区域的序列特征

提取67个样本中外源piggyBac的特征性识别位点TTAA两侧各5bp的序列,分析其碱基组成,结果显示:在T TAA两侧各5bp区域内,AT碱基明显多于GC碱基;其中63个整合位点两侧含有T或A碱基,17个整合位点位于TA之间,21个整合位点位于TA一侧(图3)。

以TTAA为起点,提取IS-1～IS-50整合位点两侧各10Kb的基因组序列进行分析,结果如表1所示:在piggyBac整合位点上游基因组序列中,20条序列被注释为转座酶或反转录酶,8条序列被注释为核酸内切酶和类反转录酶蛋白,7条序列为功能未知基因和其它基因(与C-type lectin、fez1和innexin 2等具有相似性),15条序列未检索到注释结果。整合位点下游基因组序列注释结果与上游序列类似,22条序列被注释为转座酶或反转录酶,4条序列被注释为核酸内切酶和类反转录酶蛋白,9条序列为功能未知基因和其它基因(与FGFR1 oncogene partner 2、fez1和membrane protein TMS1等具有相似性),15条序列未检索到注释结果。据此可以推测,尽管piggyBac转座子是以随机方式插入到宿主基因组,但其在插入位点的选择上更倾向于转座子/反转座子聚集的热点区域(hot spot regions),这可能是包括piggy-Bac在内的某些转座子的共同特征,同时也可能是宿主对转座子进行广泛防卫以减少其对自身危害的结果。

图3 piggyBac靶位点序列T TAA两侧各5个碱基位置的碱基组成

表1 piggyBac整合位点两侧各10Kb序列的基因注释结果

3 讨论

自1998年piggyBac转座子首次被用于果蝇转基因[17]并获成功以来,国内外对该转座子的研究主要集中在利用其获得转基因个体从而进行基因功能解析等方面,在家蚕中还被应用于遗传素材创新和生物反应器研究。但总的来说,目前对piggyBac在转基因生物体基因组中的插入与整合位点特征、遗传与表达稳定性等具体信息还知之甚少,而这又是开展转基因研究所不能回避的重要内容。最近,研究人员开始关注并研究了转基因小鼠[18,19]、人源T细胞[20]、疟原虫[21]等基因组中外源piggyBac的整合位点特征,获得的相关实验证据为利用其开发插入诱变等高效遗传分析工具提供了重要参考。但在家蚕中,外源piggyBac的整合位点有何规律或独特特征?这是开展家蚕转基因研究必须回答的问题之一。

本研究初步证实,外源piggyBac在家蚕基因组中的整合位点呈以下特点:1)在染色体上的分布广泛且无规律,这与piggyBac以随机方式插入整合的特征一致。但从其特征性位点T TAA两侧的碱基组成来看,piggyBac更倾向于插入到富含A、T、AT或TA碱基的区域,这可能有利于转座酶识别基因组中的T TAA位点并催化piggyBac发生转座;2)在整合位点两侧各10Kb的区域范围内,注释基因多为转座酶、反转录酶或类反转录酶蛋白等,推测其可能为piggyBac插入整合的热点区域(hot spot regions)。这一特点类似于大多数其它类型的转座子,亦可能有利于piggyBac的转座插入;3)piggyBac能够插入到基因内部区域。尽管本研究中暂未检测到插入基因外显子区域的例子,但至少可以证实,外源piggyBac能较容易的在家蚕基因内部发生转座整合,提示利用其开发插入诱变、基因诱捕、增强子或启动子诱捕等家蚕功能研究工具是可行的。

尽管利用piggyBac转座子开展家蚕转基因研究不过10年,但已经取得了令人振奋的长足进步。通过对转基因家蚕中piggyBac的整合位点等特征进行研究,将有助于我们进一步了解并挖掘其利用潜力,为利用转基因技术研究家蚕基因功能、创建新型素材和蚕品种以及开发家蚕生物工厂等提供基础参考。

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