刘春 陈玉琳 代方银 韩宇 魏丽婉 刘品彦 任静波 夏庆友

(西南大学蚕学与系统生物学研究所,重庆 400716)

家蚕是重要的经济昆虫,其最大的经济价值在于其能够吐丝,而丝腺作为家蚕最大的器官,是唯一能够分泌丝蛋白的器官,它能高效特异的合成丝蛋白。一头家蚕拥有两条左右对称的绢丝腺,一般经过25d左右的生长发育,在幼虫期食下鲜桑叶约22g,由其绢丝腺特异合成并分泌0.5～lg的丝蛋白[1]。家蚕丝腺高效特异的合成丝蛋白的机制长期以来是丝腺研究的一个重点和难点。

家蚕丝腺是核内复制组织,其内的基因组没有有丝分裂和核分裂,而是进行多次的复制,它的细胞分裂仅限于胚胎阶段,在整个幼虫发育过程中不再分裂[2]。幼虫丝腺细胞的数目,前部丝腺(anterior silkg land,ASG)约300个,中部丝腺(middle silkg land,MSG)约250个,后部丝腺(posterior silkg land,PSG)约525个[3]。在幼虫发育阶段这些细胞在体积上继续增长,尽管细胞或细胞核不再分裂,但DNA在没有有丝分裂的情况下继续复制,因此细胞质里充满了大量的树突状的DNA[4,5,6]。丝腺这种特殊的核内复制方式是丝蛋白高效合成丝蛋白的细胞生物学基础。在家蚕遗传资源库中,保存有不少茧丝突变品种,这些突变种因丝蛋白合成受阻成为研究丝蛋白合成机制的良好材料。目前研究比较多的丝腺突变品种有:裸蛹Nd、Nd(2)、丝胶茧Nd-s(02-020)和丝胶茧D Nd-sD;Nd的突变位于25连锁群,它不分泌丝素,茧层仅含丝胶,极薄,多数不能成茧;Nd-s及Nd-sD乃由定位于14连锁群由f ib-L突变引起的,它们由于丝素轻链不能正常合成,作成只含丝胶的茧,这两者的茧丝突变形状很相似[1];对于Nd,前人在研究中发现蚕体绢丝腺退化,丝素基因转录量很低,仅是正常大造的十几分之一,半数不能正常吐丝结茧[7]。笔者在本文中对该突变品种丝腺及其丝腺细胞的发育特点,从形态学上对其丝腺进行比较观察,为揭示其突变机理奠定基础,为阐明丝蛋白合成机制提供一定的理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料

Nd、Nd-s及大造均由西南大学家蚕基因资源库保存提供。饲养条件:室温(25℃左右);常规桑叶育饲养。

1.2 取材方法

以两根解剖针分别拉扯家蚕头部和尾部的方式(适于低龄期蚕),或解剖盘内以大头针固定、眼科剪剪开蚕体从而取出丝腺的方式(适于3龄以后蚕),获得不同品种家蚕不同龄期及眠期的丝腺,经甲醇固定,再以荧光燃料DAPI对其细胞核进行染色5～10min,并在显微镜(O-lympus BX51)紫外光激发(Olympus BH2-RFL-T3)下观察染色结果,同时拍摄记录下结果。

1.3 丝腺的不同区域的鉴定方法

在紫外光的激发下,经DAPI染色后的丝腺细胞核清晰可见;而由于生理结构上MSG明显比ASG、PSG的腺腔更宽大,因此,在蚁蚕丝腺细胞核均呈点状的情况下,通过对腺腔大小的比较,则可明确找到ASG与MSG、MSG与PSG的分界处。

1.4 统计分析

求平均值:去掉该组数据中的极大/极小值,再求和除以个数;方差分析参考文献8.

1.5 f ib-H末端序列测序

提取Nd及大造PSG的RNA合成cDNA(Takara),其方法按试剂说明书进行。根据f ib-H基因的末端序列设计引物:F:5'-GGAACAGGCTCTTCTGGATT TG-3';R:5'-GCGGACGT TACGACGAGAA-3'。利用合成的cDNA作为模板进行RT-PCR获得目的片段;胶回收试剂盒回收PCR扩增的目的片段,然后与pMD19-T simple载体连接,经转化后挑取阳性克隆进行培养、质粒DNA提取及测序反应(上海生工)。

2 结果与分析

2.1 三品种家蚕MSG、PSG细胞数量考察

家蚕丝腺起源于外胚层的器官,细胞的分裂仅在胚胎期经10次分裂而完成;丝腺母细胞是二倍体(2n),含有两份基因组DNA[1];在幼虫期,丝腺细胞不再分裂,随着蚕体的生长,只有丝腺细胞的肥大生长和细胞核内有丝分裂,因此,其细胞数量是不会发生变化的[1];在蚁蚕期,家蚕丝腺细胞核呈点状,形态清晰,数量明确,细胞核的个数即为细胞的数量;在5龄3天,Nd的后部丝腺与正常相比,极其的短(图1),但这种短小是否是由于丝腺的细胞数的减少引起的未知,因此,我们首先对丝腺的细胞数进行了调查。通过DAPI对每个品种10条蚁蚕的细胞核进行染色观察后,得到了以下统计结果:

表1 蚁蚕细胞数目平均值统计表

由表1可见,大造、Nd-s、Nd三品种的MSG细胞数均是200个左右,PSG细胞数约400个左右;即三者的MSG与PSG总数都在620个左右,较小的差别也是由于品种差异产生的。因此,它们丝腺的细胞个数差异不大,则三品种丝腺在生长发育中将表现出的差异,与丝腺细胞的数目关系不大。

2.2 Nd丝腺及其细胞核发育的形态特征

Nd突变品种丝腺表现出的萎缩现象不是由丝腺细胞的多少引起的,那很有可能是后部丝腺细胞的发育异常而引起的,因此,我们就不同发育时期的丝腺细胞进行了观察。根据对各个龄期和眠期的比较观察发现,Nd丝腺细胞的发育与两种对照相比,从1～4龄期,3者的丝腺基本没有什么差异,丝腺细胞核都增大,从3龄开始,丝腺细胞核开始发生扩散复制,呈弥散状,如图2所示。从5龄起开始,Nd丝腺细胞的大小和形态与对照相比就有明显的差异,如图3所示。两对照品种Nd-s及大造的后部丝腺的细胞核呈树突状弥散态,不仅有纵向的扩展,还有很多横向的分支,如树叉一样的密密地占据了每个细胞的空间,而Nd丝腺细胞核物质如柱状扩散,主要呈纵向的扩展,没有树叉状的核分裂现象。由于这种核分裂方式的差异,导致Nd的细胞体积明显的比Nd-s和大造的小(如图4中虚线框出的即是一单个细胞),从而使他们后部丝腺的整体长度也大大超过了Nd,通过观察,我们认为Nd的突变基因与细胞核分裂有关。

图1 大造、Nd-s、Nd 5龄3天丝腺图

图2 2～5龄大造、Nd-s、Nd后部丝腺细胞核DAPI染色图

图3 5龄3天大造、Nd-s、N d中部丝腺细胞核DAPI染色图

图4 大造、Nd-s、N d 5龄3天PSG细胞核DAPI染色结果

2.3 f ib-H基因末端序列的比较

由于在前人的研究中,Nakano,Y.等人[9-11]研究发现,Nd(2)PSG的细胞数量与正常的PSG相同,MSG也是正常的,且按正常水平分泌丝胶,分子水平的证据表明该突变品种丝腺细胞里有Fib-LmRNA的存在,但在丝腺腔中和形成的丝中却缺乏Fib-L蛋白,因此认为该突变很有可能是Fib-H蛋白C端发生突变导致其不能与Fib-L蛋白进行结合而影响丝蛋白的合成和分泌。根据本文前面的研究结果表明,Nd的突变表型与Nd(2)十分相似,因此,我们推测该突变也很有可能与Nd(2)的突变机制相同。为了测定f ib-H基因序列末端二硫键是否在Nd发生突变,我们设计了引物对f ib-H的末端序列进行了序列鉴定,测序结果表明,Nd C端的位于C端起的第20个氨基酸处的半胱氨酸与大造品种相比并没有发生突变,可能由于品种间的差异,大造及Nd的C末端的序列与目前报道的f ib-H基因序列有差异,但在半胱氨酸却是相同的(图5)。由此可见,Nd的突变不是发生在f ib-H基因末端的半胱氨酸位点,而是由其它位点或者其它基因突变造成的。

图5 各品种fib-H基因测序结果比对

3 讨论

Nd是绢丝腺突变品种,茧丝缺乏丝素蛋白,具有茧丝很薄及半数裸蛹的现象,是研究家蚕丝腺基因转录调控和丝蛋白合成分泌的良好材料。本研究对其丝腺细胞数目及发育状态进行了初步的观察和研究,结果表明,Nd中部及后部丝腺细胞数目与正常家蚕无明显差别;五龄期中部丝腺长度与对照无差异,但后部丝腺却十分短;通过对其幼虫发育过程中细胞核的观察得知,Nd中部丝腺细胞核分裂与对照无差异,但后部丝腺的细胞核不发生树叉状的分裂,其细胞长度比对照小,导致后部丝腺短小;对f ib-H基因的末端测序结果表明,该突变在f ib-H的C末端的起重要作用的半胱氨酸位点也没有发生突变。根据我们的观察认为,Nd突变品种丝腺的短小不是因为丝腺数目的减少而引起的,而是细胞核缺少树叉状分裂导致细胞的体积变小。因此,认为该突变基因可能与丝腺细胞核分裂有关。

在家蚕25号染色体上0.0座位,有几个等位的裸蛹(Nd)突变品种,其中,Nd(2)是Nd类突变种之一,也是产生一种不含丝素的茧,其PSG在长度上相当短,不发达,且只能产生很少的丝素,连锁分析表明该突变与f ib-H基因紧密连锁,Nakano,Y.等人[9-11]根据他们的研究结果认为,Nd(2)很有可能是f ib-H蛋白C端发生突变导致其不能与Fib-L蛋白进行结合而影响丝蛋白的合成和分泌。虽然目前我们不知道Nd(2)和Nd是否是相同的突变品种还是等位突变品种,但据我们的观察认为,Nd突变品种是由于f ib-H基因突变的可能性比较小,尽管该突变品种也与f ib-H基因紧密连锁。在正常的丝蛋白中,f ib-H蛋白、Fib-L蛋白及P25蛋白分别以6∶6∶1的比例形成丝素蛋白小体,该小体的正确形成对丝蛋白的分泌起极其重要的作用[18]。在我们选用的对照品种中,02-020即Nd-s突变种,该突变品种丝素蛋白Fib-L基因发生突变导致其产生异常的蛋白[17]。正是由于该突变品种丝腺细胞内不能形成丝素小体,导致其丝素蛋白的合成和分泌受阻,因而,其茧丝缺乏丝素。从我们的观察结果可知,02-020突变品种无论是在丝腺细胞数、细胞核的分裂情况及丝腺长度,与大造都没有明显的差异,Fib-L基因作为丝蛋白的结构基因,它的突变不影响丝腺的正常发育,只是影响丝蛋白的合成和分泌。由此我们认为,同样作为丝素主要结构蛋白的f ib-H基因突变会引起丝腺细胞核的发育异常的可能性很小,因此,我们推测Nd的突变基因不太可能是f ib-H基因,其末端的测序结果也排除了起关键作用的半胱氨酸位点发生突变。目前,家蚕基因组精细图谱已经完成,遗传连锁图谱与物理图谱也一一对应,同时,家蚕全基因组不同组织的基因芯片表达谱也公布于众。在我们下一步工作计划中,将根据这些信息平台,结合目前我们对Nd初步的研究结果,对家蚕25号染色体进行全染色体分析,期望为我们克隆该突变基因找到一些线索。

家蚕丝腺具有重要的经济价值,在20世纪80年代末,家蚕作为生物反应器的重要应用已引起科学工作者的重视,特别是以家蚕丝腺为生物反应器[12]。虽然现今以家蚕丝腺构建研究高效率分泌蛋白质的生物反应器有着非常大的开发前景,但仍然面临着外源蛋白在丝蛋白中的含量比较低,且外源蛋白多以融合蛋白形式表达、分离纯化过程有一定的难度的困难。因而,这种缺少丝素的丝对于研究外源蛋白的分离纯化过程将有重要的价值。

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