曾媛琴 莫琳 朱勇 龚竞

(西南大学生物技术学院,重庆 400716)

目前,昆虫对有毒物质产生抗性的研究主要有三个方面,即:生理抗性、代谢抗性、行为抗性。生理抗性是指表皮穿透率降低,分隔作用,脂肪体等惰性部位贮存有毒物质的能力增强,排泄作用及靶标部位敏感度降低等引起的抗性;代谢抗性是指由于抗性昆虫利用解毒酶的量或质的变化来迅速降解有毒物质而引起的抗性[1]。

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE,EC3.1.1.7)在神经突触间隙中通过催化水解神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)来维持神经冲动的正常传递[2-4]。AChE是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标,活性位点丝氨酸被磷酰化和氨基甲酰化后,神经冲动的正常传导功能被阻断,因此可以通过测定AChE活力被抑制的程度快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量[5]。

AchE对有机磷杀虫剂的抗性机制是在ABE结构基因上的多位点突变,形成几种不敏感的AChE同功酶[6]。昆虫的AChE的基因突变有可能导致该酶对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂敏感性降低[7-8]。除了酶性质发生改变外,昆虫也可通过AChE基因表达量的增加而对杀虫剂产生抗性。在果蝇中,AChE的过量产生导致了对马拉硫磷的高度抗性[9]。有机磷抗性麦二叉蚜AChE活性显著高于敏感个体,通过Southern blot和Northern blot分析表明,抗性个体AChE活性不是由于基因突变造成的,而是由于基因表达量增加所致[10-11]。

我们在以前的实验中发现了家蚕耐氟性产生的两条重要途径,其中之一位于头部组织,家蚕乙酰胆碱酯酶主要在头部组织表达。我们通过浸叶法添氟检测氟是否对家蚕的乙酰胆碱酯酶产生影响。

1 材料与方法

1.1 家蚕品种

家蚕耐氟品种秋丰x白玉,敏感品种734,25℃恒温,75±5%湿度养育,人工光照16h,黑夜8h。每天喂养3次新鲜桑叶。分为清水对照组秋丰x白玉C(秋*白C)和734C、氟处理组秋丰x白玉F(秋*白F)和734F(4龄起蚕开始饲喂用200ppmNaF浸泡25分钟后自然晾干的桑叶)。每组各100头,分为10区,每区10头,用于取样检测。每天每组随机取10只,解剖获取头部组织,用生理盐水和DEPC水冲洗后,液氮速冻,-80℃保存备用。

1.2 主要实验试剂及仪器

1.2.1 主要试剂

考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)(上海化学试剂公司);碘化硫代乙酰胆碱(AcetylthioeholineiodideATChI)(上海生工);5,5'-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)(上海生工);

1.2.2 主要仪器

190型酶标仪(美国FT公司);冷冻离心机(湖南湘仪有限公司)。

1.3 酶原蛋白含量的测定

1.3.1 酶液的制备

挑取各组5只幼虫头部组织,加入1ml,0.01MpH8.0的PBS(含0.1%T riton),冰浴匀浆。匀浆液转入1.5ml离心管,4℃15 000rpm离心30min,取上清液备用。

1.3.2 蛋白质含量标准曲线的制作

参照Bradford[12]考马斯亮蓝G-250法进行测定。不同含量(0,1,2,3,4,5ug)的牛血清白蛋白、0.05MpH7.5PBS共50ul,与0.01%,200ul考马斯亮蓝G-250在37℃反应10min,595nm条件下测其OD值(表1)。以牛血清白蛋白含量(μ g)为横坐标,OD值为纵坐标制作标准曲线。

表1 蛋白质含量测定

1.3.3 酶原蛋白含量的测定

参照Bradford考马斯亮蓝G一250法,按照表1步骤进行测定,根据标准曲线求出家蚕头部组织酶原蛋白质含量(μ g pro/insect)。

1.4 AChE活性的测定

1.4.1 酶液制备

酶液制备方法参照1.4.1。

1.4.2 活性测定

参照Ellman[13]方法并加以改进。用碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)作底物,经AChE水解后生成硫代胆碱和乙酸,与DTNB生成黄色物质,于37℃反应10min,412nm下测定其OD值,扫描20min,每20sec读一次数,并计算AChE活力(nmol.min.-1·insect-1)。

2 结果

2.1 家蚕乙酰胆碱酯酶酶原蛋白的测定

以牛血清白蛋白为标准蛋白测得标准取钱,得到回归方程式:y=0.1077x+0.9886(y代表OD值,x代表蛋白质含量g),相关系数R2=0.9995。

根据蛋白质标准曲线和所测酶液的OD值,计算出家蚕4龄以后每天酶原蛋白含量。结果显示,4龄期,除了734F,各组的耐氟品种秋丰x白玉显示了与敏感品种734的不同。4龄起蚕开始添氟后,734F的酶原蛋白含量4龄1天急剧降低,4龄2天以同样的速率急剧升高,4龄3天,终于酶原蛋白含量升到1.114ug,比734C增加了0.12%,却再也无力上升,急剧下降,最终全部死亡(图1)。秋丰x白玉F从添氟开始,酶原蛋白含量急剧升高到1.13ug,比对照组增加了2.0%,然后急剧下降,进入眠期。5龄起蚕添氟后,酶原蛋白含量升高时间晚于对照组一天,增长速率却大于对照组,最终酶原蛋白含量始终高于对照组(图2)。同时可以看到,耐氟品种添氟组酶原蛋白含量始终高于敏感品种添氟组。

图1 4龄对照组和处理组酶原含量

图2 秋丰X白玉4～5龄AChE酶原蛋白含量

2.2 家蚕乙酰胆碱酯酶活性检测

家蚕4龄起蚕添氟,耐氟品种秋丰x白玉与敏感品种734 AchE活性差异显著。秋丰x白玉F酶活性与对照组差异不大,734F添氟开始AchE活性就远远小于对照组(图3)。秋丰x白玉F从4龄开始酶活虽然与对照组相差不大,但一直略小于秋丰x白玉C。耐氟品种秋丰x白玉F酶活性始终高于敏感品种添氟组。

图3 不同品种家蚕4龄AChE活性

图4 秋丰x白玉4～5龄AChE活性

3 讨论

本实验研究了添氟对家蚕乙酰胆碱酯酶蛋白含量和酶活性的影响。毫无疑问,氟对家蚕乙酰胆碱酯酶造成了影响。敏感品种的酶原蛋白含量远远低于对照组,虽然也曾上升,但最终最多只能比对照组增加0.12%。而耐氟品种秋丰x白玉F却能够比对照组增加2%,是敏感品种734的16.7倍。而且耐氟品种秋丰x白玉F的酶原蛋白含量几乎一直高于对照组。因此我们认为,乙酰胆碱酯酶基因表达量的增加是家蚕耐氟性的原因之一,而且耐氟性能力的强弱与乙酰胆碱酯酶表达量增加的多少直接相关。

我们检测了4龄开始每天的乙酰胆碱酯酶活性。实验显示,氟对家蚕乙酰胆碱酯酶活性产生了重要影响。添氟品种的乙酰胆碱酯酶活性始终低于对照组。敏感品种734添氟开始酶活性相差非常大,相差了14%,并且活性始终未能增加到和对照组持平;耐氟品种秋丰x白玉添氟开始活性却相差不大,我们估计与添氟开始酶原蛋白含量的急剧增加相关。虽然从4龄到5龄,秋丰x白玉F的AChE活性略低于对照组,但总是有等于对照组的时候(4龄2天,4龄4天,5龄3天和5龄5天),我们认为这与酶原蛋白始终高于对照组有关。

乙酰胆碱酯酶基因表达量的增加弥补了乙酰胆碱酯酶活性的受损,使乙酰胆碱酯酶活性总体持平,从而使家蚕产生了耐氟性。我们在以前的氟检测中发现了家蚕耐氟品种有两条重要的耐氟途径,其中之一就是头部组织产生的耐氟性。我们认为乙酰胆碱酯酶基因表达量的增加就是头部组织耐氟性的重要原因之一。乙酰胆碱酯酶基因表达量增加的分子途径和氟究竟是怎样导致敏感品种的乙酰胆碱酯酶酶原蛋白含量的降低等值得我们进一步的深入研究。

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