弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的呈世界性分布的严重危害人类健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病。免疫功能正常的人多呈隐性感染,而孕妇感染弓形虫后可导致流产、早产、畸胎、死胎等,成为影响人类优生优育的一种重要生物病原。怀孕动物感染弓形虫后出现流产、死胎,甚至还会引起患病动物大批死亡,给养殖业带来巨大经济损失。近年来,弓形虫病的诊断方法以普通病原学和免疫学诊断为主,而随着分子生物学技术的不断发展,逐步建立了核酸探针,PCR,基因芯片以及LAMP等多种快速、准确的检测方法,使该病的诊断方法日益完善。本文对弓形虫分子诊断技术的发展加以综述。

1 核酸探针技术

核酸探针技术又称核酸杂交(nucleic acid hybridization),是由华盛顿卡内基学院Roy Britten及同事于1968年发明的一种重要的分子生物学技术。该技术的基本原理是将某一特定病原已知基因的全部或者部分序列预先分离纯化后加以标记作为探针,与变性分开的待检DNA或RNA单链在同一退火温度下,相应的同源区段便会发生特异性互补,形成杂交双链。洗涤除去未杂交上的标记物后用自显影技术进行检测,便可检测出与特定序列结合的核酸样品,从而达到检测病原的目的。根据探针类型不同分为基因组DNA探针、RNA探针等。Blanco等〔1〕建立弓形虫RH株基因文库,从中筛选出pT g4重复片段。将此片段用放射性同位素32P标记作为探针,可检测到80pg纯化的弓形虫基因组DNA。

由于放射性同位素标记的核酸探针容易污染环境,且对人体有一定损害。所以在推广应用上受到较大的限制。因此,近年来非同位素标记核酸探针有了较大发展。Angel等〔2〕用地高辛标记探针 ABGTg4检测6例疑似弓形虫脑炎患者的脑脊液,发现有4例阳性,与临床检出符合率到达100%。程彦斌等〔3〕利用地高辛配基(Dig-11-dUTP)标记弓形虫B1基因的部分序列(207 bp),通过斑点杂交能够检测出25pg的纯化弓形虫核酸。且特异性良好,用该探针检测急性感染的小鼠,在感染24 h后可从组织中,48 h后可从外周血中检测出弓形虫。

2 PCR及其衍生技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)是20世纪80年代发展起来的一种体外核酸扩增系统。其快速、灵敏、操作简便等优点使之在短时间内即被广泛应用。目前,有很多基因可用作弓形虫的PCR检测,最常见的有B1基因,529 bp重复序列以及P30基因。它们在弓形虫基因组中均具有高度保守的特点。PCR及其衍生技术已广泛应用于弓形虫病临床诊断,在分子生物学诊断中占有重要的地位。

2.1 普通PCR技术 Burg等〔4〕利用弓形虫 B1基因,首次将PCR技术用于弓形虫病的诊断。其灵敏度可以达到检测单个弓形虫速殖子基因组DNA的水平。单连玉等〔5〕根据Burg建立的上述PCR方法,检测感染组织内的弓形虫,肝脏组织样本检出率为81.8%,血液样本检出率达 100%。崔平等〔6〕以弓形虫P30基因为PCR引物,可以检测出5个弓形虫速殖子的DNA。并且可在病猪的肝脏、肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肠系膜淋巴结、腹水的DNA样品中检测出弓形虫。该方法特异性较好。

2.2 PCR-RFLP技术 将PCR技术与限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)结合建立的PCR-RFLP技术,可以在诊断弓形虫病的基础上鉴定弓形虫的强、弱虫株,揭示个体或群体间遗传变异情况。Ferreira等〔7〕用间接免疫荧光、ELISA 以及PCR诊断确诊87例患有弓形虫病的艾滋病病人和脑弓形虫病人后,对他们的脑脊液样本采用4个基因标记多位点PCR-RFLP进行基因分型,并且这4个标记能够对弓形虫的3个无性繁殖的克隆世系进行清楚的分型。结果发现除了经典的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型外,还发现了多态性虫株,该实验证实了弓形虫巴西分离株具有很高的遗传多态性现象。

2.3 原位PCR 将原位杂交技术的定位性与PCR技术的高敏感性结合起来的原位PCR(in situ PCR),能在组织切片或细胞涂片上原位对特定DNA或RNA进行扩增,省略了提取DNA的繁琐步骤,对于样本量少或不能获得较大样本组织的检测提供了一个可行方法。按照检测方式的不同可分为直接原位PCR和间接原位PCR。李爽等〔8〕利用直接原位PCR扩增并检测以弓形虫RH株速殖子感染小鼠肝脏的切片标本,病原体检出率为100%,而用免疫组化方法检测冷冻切片标本的检出率为61%,可见原位直接PCR方法较免疫组化法有很大的优势。卢慎〔9〕以弓形虫 B1基因设计引物,并用地高辛标记探针,采用间接原位PCR的方法检测86例病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎石蜡切片组织样本,发现弓形虫阳性率为54.65%。

2.4 套式PCR 套式PCR(Nested PCR)是一种利用2对引物(外引物和内引物)对目的DNA序列进行扩增的诊断技术。靡祖煌等〔10〕以弓形虫B1基因为靶基因,设计了4条特异性引物。以外套引物PCR体系进行第1次扩增,其产物作为第2次扩增的模板。经过2次扩增,敏感性较普通PCR提高了100倍。除能在RH株与地方分离株DNA样品中扩增出条带外,人组织及其它微生物DNA均扩增不出任何条带,提高了特异性。Esmerini等〔11〕用该方法以弓形虫B1基因检测海洋生物牡蛎和蛤蜊。在牡蛎样本中,弓形虫的出率为3.3%。而在蛤蜊样本中,经检测证明没有弓形虫的存在。

在套式PCR的基础上改进设计的单管半套式PCR(hemi-nested PCR)检测更为快速、敏感、特异。且由于在一个管内完成2次扩增反应,可减少污染机会,消除假象。现已成功应用于弓形虫病检测。孔得翔等〔12〕针对弓形虫RH株P30基因设计了3条特异性引物,建立了半套式PCR检测体系。扩增产物测序表明,与P30基因一致性为99.8%。且特异性强,与健康猪血液及猪常见细菌、病毒病无交叉反应;敏感性高,可检测出18fg弓形虫基因组。

2.5 实时定量PCR 实时定量PCR(real-time quantitative PCR)是一种将探针技术和PCR技术结合起来进行准确定量的PCR方法,可通过PCR扩增后的DNA产物含量来推算原来标本中特定DNA或mRNA的含量。因探针常用荧光物质标记,所以又称荧光定量PCR。王频佳等〔13〕以弓形虫529 bp重复序列部分片段构建重组质粒作为模板,建立荧光定量PCR。经多组实验得到Mg2+浓度1.5 mmol/L,引物浓度为 0.5 μ mol/L,探针浓度为1.0 μ mol/L的最佳反应条件。用 104～1010拷贝/μ L的起始模板制作的标准曲线循环阈值与模板浓度显示出良好的线性关系,相关系数0.995,平均试验间变异系数为3.28%,且没有非特异性扩增。该方法检测临床标本,阳性率为43.3%。

朱祥明等〔14〕以 B1基因建立弓形虫 SYBRGreen1荧光定量PCR检测方法,检测弓形虫B36虫株为阳性,血吸虫、恶性疟原虫为阴性,孕产妇检测样本阳性率达 16.7%,无偿献血者样本为0.74%。Yang W 等〔15〕以B1基因和529 bp重复序列为目的基因设计引物建立的实时定量PCR,检测水样本中的弓形虫卵囊,可达到检测到1个弓形虫卵囊的灵敏度。Wallon等〔16〕用该方法对不同怀孕期妇女羊水进行弓形虫检查,准确率为100%。

3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 Notomi等〔17〕于 2000年开发的一种等温核酸扩增方法。其特点是设计4条引物,结合目的基因的6个特异性区域,在具有自主链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下,恒温65 ℃作用30 min～1 h即可扩增109～1010倍,完成反应。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳呈典型的阶梯式条带,而且在反应过程中,能产生肉眼可见的焦磷酸镁白色沉淀,使基因扩增和产物检测可一步完成。反应中不需要对模板热变性以及长时间的温度循环,因此不需要昂贵的仪器设备,普通的加热装置即可。该检测方法速度快,操作简便,结果观察容易,非常适合于在小型实验室和基层单位推广。

Sotiriadou等〔18〕根据弓形虫 TgOWP 和B1基因建立了 LAMP方法,以检测水中弓形虫。用LAMP与套式PCR同时检测26个弓形虫阳性水样,LAMP检出率为100%,而套式PCR为53.8%。另用LAMP、PCR和免疫荧光试验(IF T)分别检测52个来自不同地区的自然水样,结果弓形虫检出率LAMP为48%,套式 PCR为 13.5%,而 IFT结果全阴性。通过对比实验发现,LAMP能够快速、特异且敏感地检测水样中弓形虫污染。Zhang等〔19〕根据弓形虫529 bp重复序列建立LAMP方法,与常规PCR方法同时对疑似感染弓形虫猪的淋巴结进行检测,结果 LAMP阳性率为85.7%,而常规PCR阳性率为76.9%,说明LAMP方法可作为家畜弓形虫病的分子诊断工具。Krasteva等〔20〕利用弓形虫单一拷贝的SAG1基因设计引物建立了LAMP诊断方法,对人工感染弓形虫小鼠的不同组织样本进行弓形虫检测,并与常规PCR方法进行比较,发现其灵敏度明显高于常规PCR。在我国,杨秋林等〔21〕根据 B1 基因 ,刘郎等〔22〕根据 529 bp 重复序列建立了弓形虫 LAMP检测方法。结果均显示LAMP在弓形虫检测中有良好的特异性与敏感性。

4 DNA微阵列

DNA微阵列(DNA microarray)是在DNA杂交测序芯片的基础上,经改良发展出来的一种分离、检测基因的方法,简称基因芯片(gene chip)技术。该技术自1989年提出以来,人们对它的研究一直方兴未艾。该技术是将大量DNA片段按特定排列方式固定于尼龙膜、玻璃、硅片等载体上,形成致密有序的分子点阵,与荧光素等标记的探针分子在同一条件下进行核酸杂交,经共聚焦激光扫描仪扫描,利用数据分析软件获得杂交结果。具有高通量,平行性的特点,可同时对多种疾病进行检测。该技术已在弓形虫致病机理,分析其感染过程宿主基因表达谱等基础研究中广泛应用〔23-24〕。Odenthal等〔25〕以68个淋巴腺炎病人的石蜡包被的病料作为核酸样品来源,经套式PCR与多重PCR鉴定病原后,建立了低密度微阵列(low-density microarray)。结合多重PCR制备的探针,可检测出包括弓形虫、分枝杆菌、耶尔森氏菌等在内的多种病原。结果显示出了较强的特异性与可重复性,可以灵敏地同时检测多种病原。

5 总结与展望

综上所述,基于遗传标记的分子生物学诊断技术为弓形虫病的诊断提供了非常有效的检测手段。分子生物学诊断技术较传统病原学检测具有检测速度快,检出率高等优点,大大减少了漏检的现象;与免疫学检测相比,避免了因疫苗免疫或一过性患病而产生抗体的假阳性的结果。虽然各种分子生物学诊断技术都有一定局限性,但特异性强和敏感性高的优点仍显示出良好的应用前景。因此,简单、灵敏、快速的分子生物学诊断技术,对于弓形虫病的临床诊断、进出口检疫和流行病学调查非常重要,是弓形虫病诊断的发展趋势。目前,国内外均有弓形虫病分子生物学诊断试剂盒申报专利,而不断加大临床样本检测数,逐步完善试剂盒的相关指标,将此技术由实验室推向基层,才是弓形虫病分子生物学诊断技术发展的最终目标。相信随着分子生物学的进一步发展和对弓形虫基因功能研究的深入,必将开发出更加特异、敏感的检测方法,从而达到快速、准确诊断弓形虫病的目的。

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