铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)是常见的非发酵糖G-专性需氧小杆菌,广泛存在于土壤、水、污物、植物和动物中,常定植于健康人的上呼吸道、肠道和皮肤等处,是免疫抑制个体重要的机会致病菌。铜绿假单胞菌感染一旦发生,多为慢性病程,引起肺实质损伤,常导致患者死亡。由于铜绿假单胞菌膜对药物渗透障碍,引起多种抗生素天然耐药。在治疗过程中,通过基因突变发生耐药,使铜绿假单胞菌感染治疗十分棘手,死亡率高。疫苗是预防感染性疾病发生的有效方法,本文介绍了6种Pa疫苗构建及其免疫机制等方面的研究进展。

1 灭活疫苗

灭活疫苗(inactived vaccine)又称为死疫苗,是病原体大量培养以后,经理化方法灭活后制成。Cripps等〔1〕应用 Boehringer-Ingelheim 制备的低压冷冻甲醛灭活的Pa385株(2血清型、21/44/109/110X/1214噬菌体型)肠溶口服疫苗Pseudostat,每粒150 mg,含 2×1011CFU。1 d、28 d给予健康志愿者150 mg口服免疫,末次免疫后观察2 w,安全性良好。在免疫14 d后,血清特异性的IgA抗体明显增加,持续到42 d;血清特异性的IgM 抗体也明显增加,28 d恢复正常;在整个观察期IgG无明显变化,提示疫苗不能很好诱导 Th1型免疫反应;免疫血清能明显增加巨噬细胞的调理吞噬作用。

2 减毒活疫苗

减毒活疫苗(live-attenuated vaccine)是用减毒或无毒力的活病原微生物制成。aroA基因编码5-烯醇酮莽草酸三磷酸合成酶,是植物和细菌合成芳香族氨基酸的关键酶。Priebe等〔2-3〕用 108CFU、5×108CFU和109CFU PAO1△aroA减毒活疫苗依次递增鼻腔免疫C3H/HeN和BALB/c小鼠,1次/w,共3次,未出现毒性反应,4 d后肺部是无菌的。末次免疫3w后用ExoU+PAOl和O2/O5血清型PAO1攻击,全部小鼠存活,3 d后对照组全部死亡;用不同血清型Pa攻击疫苗组,未能得到好的保护率;不同类近交小鼠产生的保护率不同;与对照组相比,在疫苗组ExoU+PAOl引起的气道急性炎症明显减轻,能维持正常的肺泡结构;腹腔注射1 mg来源于鼻腔接种0.25 mg疫苗小鼠的IgG抗体,在低于主动免疫PAO1△aroA疫苗免疫剂量组有高水平的保护力。Zaidi等〔4〕用同样减毒活疫苗依次递增鼻腔免疫C3H/HeN小鼠,1次/w,共3w。末次免疫4w后,用 4 000倍 ID50(50%infectious dose,ID50)的不同血清型和不同毒力的铜绿假单胞菌攻击,均没有观察到眼睛的病理损伤,直至7 w仍有显著保护力。在被动免疫研究中,不同血清型和不同毒力的铜绿假单胞菌划伤感染眼结膜,在感染前18 h和感染后2 h腹腔注射鼻腔免疫PaO1△aroA减毒活疫苗的血清,均获得显著保护性;用不同血清型铜绿假单胞菌1.4×107CFU角膜感染后3 d,腹腔注射鼻腔免疫PaO1△aroA减毒活疫苗的小鼠血清,仍能明显减轻角膜的病理损伤;证实 PaO1△aroA减毒活疫苗血清不仅有抗菌活性,而且能阻止铜绿假单胞菌进入角膜上皮细胞。研究结果提示减毒活疫苗是安全有效的,同一疫苗对不同部位的Pa感染,保护力不同。

3 结合疫苗

结合疫苗(conjugate vaccine)是将多糖等T细胞非依赖性抗原与蛋白载体结合制成。黏液胞外多糖(mucoid exopolysaccharide,MEP),又称为藻酸盐,是由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸通过β1-4糖苷连接形成的多聚物。Pier等〔5〕发现MEP免疫小鼠后能够产生调理性抗体,有利于呼吸道清除铜绿假单胞菌,但是,单纯的MEP疫苗诱导产生抗体不足10%。Theilacker〔6〕成功制备KLH-MEP 结合疫苗,最佳免疫剂量是1 μ g/只,免疫C3H/HeN 小鼠,诱导出高浓度MEP特异的IgM和 IgG抗体,IgG在第2次免疫7 d后开始增加,第3次免疫后显著增加,35 d达高峰,持续到63 d。高剂量的MEP和KLH混合物免疫后仅产生MEP特异的IgM和KLH特异的IgG抗体,并不产生MEP特异的IgG抗体,提示KLH是良好的T细胞非依赖性抗原结合载体。陆淼泉等〔7〕将MEP与B群脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(OMPC)通过Hurwitz方法交联成功制备MEP-OMPC结合疫苗。1 d、7 d和14 d免疫小鼠3次,每次50 μ g/只,21 d和28 d诱导产生高水平抗MEP的调理性IgG抗体;29 d用1×107CFU黏液型铜绿假单胞菌腹腔攻击的保护率85%,能有效预防铜绿假单胞菌的全身感染。

4 DNA疫苗

DNA疫苗(DNA vaccine)是将编码病原体有效免疫原基因插入质粒构建重组体,经过注射等途径进入机体,转染宿主细胞,表达保护性蛋白抗原,诱导产生特异性免疫。陈建国等〔8-9〕将铜绿假单胞菌OprF 3个中和性B细胞表位和1个外源通用T细胞表位串联,采用重叠PCR方法合成DNA,在此序列前插入组织纤溶酶原激活物(tPA)的信号肽基因,将获得的片段与 MyD88基因分别克隆到pIRES载体的两个多克隆位点,构建真核双表达重组质粒 pIRES-tPA-OprF-MyD88。将该疫苗 50 μ g/次,间隔2 w,免疫3次,末次免疫2 w后采血检测抗体,疫苗组产生高水平的OprF特异性抗体,机体清除铜绿假单胞菌的能力明显增强。Price等〔10〕将长度为977 bp的oprF基因亚克隆入真核表达质粒pVR1020纤溶酶原信号序列的下游,在大肠杆菌中扩增,成功构建 pVR1020/oprF基因疫苗。于0 d 、14 d 和 28 d,pVR1020/oprF 基因疫苗(2 μ g/只)免疫ICR小鼠,末次免疫2 w后收集血清检测,主要是IgG1。IgG1/IgG2a为10.33,提示是 Th2型免疫反应,有利于抗体产生;用琼脂包埋7×102CFU铜绿假单胞菌FD4,接种在左支气管,评价疫苗对慢性感染的保护力,空载体对照组存在严重肺损伤小鼠比率是76.2%,细菌定量(＞5×103)的比率是69%,而疫苗组分别是43.2%和40.9%,提示保护力不高。

5 重组抗原疫苗

重组抗原疫苗(recombinant antigen vaccine)是利用DNA重组技术制备只含保护性抗原的纯化疫苗。Mansouri等〔11〕将 oprF-oprI基因亚克隆入大肠杆菌表达质粒,构建pT rcHis-F-I重组质粒,成功表达和纯化获得分子量为33 kD Met-Ala-(His)6-OprF190-342-OprI21-83融合蛋白 疫苗。 用 20 μ g、50 μ g、100 μ g 或 500 μ g 分别免疫健康志愿者 ,1 次/4 w,共3次,观察6个月。所有疫苗组IgG1抗体均显著增加,500 μ g组在第1次免疫后就有增加,其余组在第2次免疫后增加,提示抗体产生与接种疫苗剂量有关。实验证实疫苗组血清能增加73%接种者的调理吞噬活性。Döring等〔12〕进行了Pa二价鞭毛疫苗3期临床试验,该疫苗由20 μ g亚型为a0a1a2和20 μ g亚型为b鞭毛蛋白组成。肌肉注射疫苗3次,每月1次,1年后加强注射1次,产生高滴度的IgG、IgA和SIgA抗体;能减少66%的囊性纤维化病人感染铜绿假单胞菌。Weimer等〔13〕将flic、oprF和oprI基因亚克隆入大肠杆菌表达质粒pET29a,成功表达OprF311-341-OprI-flagellins融合蛋白,经实验证实,OprF311-341-OprI-flagellins融合蛋白既有利于PA的清除,又能减轻继发性肺部损伤,是较理想的候选疫苗。Peluso〔14〕等用来源于PAO1菌株天然 OprF(native OprF,n-OprF)和pET28a-OprF在大肠杆菌BL21表达重组OprF(histidin-conjugated OprF,His-OprF)体外刺激小鼠DCs(dendritic cells),评价抗PA保护力和炎症反应。n-OprF和His-OprF刺激DCs诱导相似的共刺激分子(CD80和CD86)和细胞因子的表达,产生高水平的IL-12p70,和低水平的IL-10以及IL-6,提示以Th1型免疫反应为主。回输被刺激DCs给C57BL/6,1w后,经鼻腔感染 3×107CFU PAOl和囊性纤维化病人分离的黏液型PA,在PAOl感染4 d和7 d后,n-OprF组根据细菌计数结果表明有显著保护力,His-OprF组在第4 d显著减少,对照组无细菌的清除;与对照组比较,局部肺组织匀浆TNF-α显著减少,IL-12p70和IL-10增加,局部淋巴结IFN-γ增加,IL-4和IL-10减少,支持局部炎症反应减轻的组织病理学的表现。在黏液型Pa感染7 d后,细菌清除延迟,有大量细菌存在,但明显抑制细菌的生长;尽管与对照组比较,IL-12p70/IFN-γ增加,IL-4减少,但 TNF-α无显著降低,炎症反应减轻程度也不及非黏液型PaO1感染后。由此可见,疫苗的保护力与病原体的清除,炎症病理的轻重,引流淋巴结是否以Th1型免疫反应为主有关,抗体可以保护机体免受PA感染,Th1型免疫反应有利于Pa的清除。

6 重组载体疫苗

重组载体疫苗(recombinant vector vaccine)是将编码病原体有效免疫原的基因转入载体(常见的是减毒病毒和细菌),并能在载体中表达,随疫苗株在体内繁殖使大量抗原得以表达而制成的疫苗。DiGiandomenico等〔15〕将编码 PA O11 血清型基因克隆入pLAFR1质粒,改称pLPS2,经过三亲杂交转入aroA突变鼠型肠沙门氏菌减毒株SL3261,成功构建LPS沙门氏菌重组载体疫苗。用该疫苗免疫BALB/c小鼠,分为口服和腹腔注射组。口服组能诱导高水平的IgG和IgA,IgG2a和IgG3明显高于IgG1和IgG2b,产生良好的黏膜免疫,在支气管灌洗液中也能观察到高水平的IgG和IgA。腹腔注射组能诱导产生高水平特异的IgG抗体,IgG3亚类最高,但未能观察到IgA的增高;IgG增高的水平是口服组的2倍,IgG3增高的水平是口服组的4倍。Arnold 等〔16〕将 编 码 Met-Ala-(His)6-OprF190-342-OprI21-83融合蛋白基因插入 pMW151、pMW209和pMW210质粒PpagC启动子的下游后,转入aroA突变鼠型肠沙门氏菌减毒株SL3261,口服途径免疫小鼠,SL3261(pMW151)可诱导最高水平的蛋白表达,但是未能诱导任何可检查到的系统的或黏膜的抗体;SL3261(pMW210)在小鼠的肠相关淋巴组织中有最好的感染,诱导中等程度的免疫反应,产生高水平的 IgA;SL3261(pMW209)可诱导高水平的IgA、IgG和IgG2a,IgG1/IgG2a分析提示以Th1型免疫反应为主。Worgall等〔17〕将 OprF蛋白的Epi1、Epi6和Epi8 B细胞表位基因插入腺病毒5(Ad5)衣壳蛋白基因组中,成功构建 AdZ.Epi1、AdZ.Epi6和AdZ.Epi8疫苗。用1×109pu分别免疫小鼠28 d后,AdZ.Epi8组产生比AdZ.Epi1和AdZ.Epi1组更高水平的抗铜绿假单胞菌IgG,再次免疫可增加7倍IgG水平。用AdZ.Epi8免疫小鼠后5 w,用致死剂量(5×105CFU)攻击,80%的小鼠存活超过2 w,对照组存活不超过48h。AdZ.Epi8免疫不同的小鼠产生不同的IgG亚类,在C57BL/6小鼠主要是IgG2b;在BALB/c小鼠中IgG2b水平比IgG2a高;在 CBA鼠中 IgG亚类水平依次是IgG2a＞IgG2b＞IgG3,证明Epi8既是B细胞表位,又是T细胞表位。AdZ.Epi8免疫C57BL/6小鼠10 d后,在小鼠脾细胞中检查到 Epi8特异性的IFN-γ增加,与对照组相比,Epi8特异性的CD4+T细胞增加18%,CD8+T细胞增加38%,证明AdZ.Epi8疫苗既诱导良好的体液免疫,又诱导产生细胞免疫,是有希望应用于临床的疫苗。

综上所述,迄今为止还没有真正的能阻止铜绿假单胞菌感染或能起治疗作用的疫苗面世,而且几乎所有的研究是在动物中进行的,少数在人体进行的临床试验也不尽人意,需要进一步研究安全性好、保护力高的疫苗。

〔1〕Cripps AW,Peek K,Dunkley M,et al.Safety and immunogenicity of an oral inactivated whole-cellPseudomonas aeruginosavaccine administered to healthy human subjects〔J〕.Infect Immun,2006,74(2)：968-974.

〔2〕Priebe GP,Brinig MM,Hatano K,et al.Construction and characterization of a live,attenuated aroA deletion mutant ofPseudomonasaeruginosaas a candidate intranasal vaccine〔J〕.Infect Immun,2002,70(3)：1507-1517.

〔3〕Priebe GP,Meluleni GJ,Coleman FT,et al.Protection against fatalPseudomonas aeruginosapneumonia in mice after nasal immunization with a live,attenuated aeroA deletion mutant〔J〕.Infect Immun,2003,71(3)：1453-1461.

〔4〕Zaidi TS,Priebe GP,Pier GB.A live-attenuatedPseudomonas aeruginosavaccine elicits outer membrane protein-specific active and passive protection against corneal infection 〔J〕.Infect Immun,2006,74(2)：975-983.

〔5〕Pier GB,DesJardin D,Grout M,et al.Human immune response toPseudomonas aeruginosamucoid ex opoly saccharide(alginate)vaccine〔J〕.Infect Immun,1994,62(9)：3972-3979.

〔6〕T heilacker C,Coleman FT,Mueschenbo rn S,et al.Construction and characterization of aPseudomonas aeruginosamucoid exopolysaccharide-alginate conjugate vaccine〔J〕.Infect Immun,2003,71(7)：3875-3884.

〔7〕陆淼泉,王复,尹秀.铜绿假单胞菌胞外粘液多糖结合菌苗的实验研究〔J〕.中国人兽共患病杂志,2001,17(3)：19-21.

〔8〕陈建国,苏兆亮,柳迎昭,等.MyD88-铜绿假单胞菌表位核酸疫苗的构建及其真核表达〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2009,25(3)：193-200.

〔9〕陈建国,苏兆亮,柳迎昭,等.MyD88-铜绿假单胞菌表位核酸疫苗的构建及其生物学作用的研究〔J〕.江苏大学学报(医学版),2008,18(6)：454-490.

〔10〕Price BM,Golloway DR,Baker NR,et al.protection againstPseudomonas aeruginosachronic lung infection in mice by genetic immunization against outer membrane protein(OprF)ofP.aeruginosa〔J〕.Infect Immun,2001,69：3510-3515.

〔11〕Mansouri E,Gabelsberger J,Knapp B,et al.Safety and immunogenicity of aPseudomonas aeruginosahybrid outer membrane protein F-I vaccine in human volunteers〔J〕.Infect Immun,1999,67(3)：1461-1470.

〔12〕Dö ring G,M eisner C,Stern M,et al.A double-blind randomized placebo-controlled phaseⅢstudy of aPseudomonasaeruginosaflagella vaccine in cy stic fibrosis patients 〔J〕.P roc Natl Acad Sci USA,2007,104(26)：11020-11025.

〔13〕Weimer ET,Lu H,Kock ND,et al.A fusion protein vaccine containing OprF epitope8,OprI,and ty pe A and B flagellins promotes enhanced clearance of nonmucoidPseudomonasaeruginosa〔J〕.Infect Immun,2009,77(6)：2356-2366.

〔14〕Peluso L,de Luca C,Bozza S,et al.Protection againstPseudomonas aeruginosalung infection in mice by recombinant OprF-pulsed dendritic cell immunization〔J〕.BMC Microbiol,2010,10(1)：9-14.

〔15〕DiGiandomenico A,Rao J,Goldberg JB.Oral vaccination of BALB/c mice withSalmonella entericaserovar typhimurium expressingPseudomonas aeruginosaO antigen promotes increased survival in an acute fatal pneumonia model〔J〕.Infect Immun,2004,72(13)：7012-7021.

〔16〕Arnold H,Bumann D,Felies M,et al.Enhanced immunogenicity in the murine airway mucosa with an attenuated salmonella live vaccine expressing Opr-OprI fromPseudomonas aeruginosa〔J〕.Infect Immun,2004,72(11)：6546-6553.

〔17〕Wo rgall S,Krause A,Rivara M,et al.Protection againstP.aeruginosawith an adenovirus vector containing an OprF epitope in the capsid〔J〕.J clin Invest,2005,115(5)：1281-1289.