赵宇，谢鹏，朱晓峰，蔡志友

（1.重庆医科大学 附属第一医院神经内科，重庆 400016；2.佳木斯大学 神经科学研究所，黑龙江 佳木斯 154007）

大鼠神经干细胞中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号转导通路的实验研究

赵宇1，谢鹏1，朱晓峰2，蔡志友1

（1.重庆医科大学 附属第一医院神经内科，重庆 400016；2.佳木斯大学 神经科学研究所，黑龙江 佳木斯 154007）

目的 应用丝裂原激活的蛋白激酶激酶（MAPKK/MEK）特异性阻滞剂PD98059孵育大鼠神经干细胞（NSC），探讨MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路在NSC中的作用。方法 体外分离、培养大鼠NSC，应用不同浓度的PD98059孵育NSC后进行WTS-8、Nestin，BrdU、β-tubulin-Ⅲ、Western blot检测。结果 PD98059对NSC的存活、增殖和分化的影响呈剂量依赖性，在PD98059较高浓度时NSC的存活率明显下降（P<0.05），BrdU和β-tubulin-Ⅲ的阳性细胞数明显少于正常对照组（P<0.05）。PD98059阻断ERK表达的作用呈剂量依赖性。结论 MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路对大鼠NSC的存活、增殖、分化起重要作用。

丝裂原激活的蛋白激酶激酶；细胞外信号调控激酶；神经干细胞

目前已知丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）在所有真核细胞中均有表达，MAPK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可被细胞因子、神经递质、激素等多种刺激因素所激活，是将细胞外信号转导至细胞内部的主要途径，MAPK激活后可磷酸化核转录因子和其他蛋白激酶等多种底物，调节相关基因转录，进而参与细胞生长、发育等多种生理过程［1～6］。神经干细胞（neural stem cells，NSC）是一种具有自我更新、多分化潜能的原始细胞，是神经发生的启动者，目前对于多种神经系统疾病的治疗方向是促进神经发生，NSC的独特优点使它成为治疗神经系统疾病的焦点［7，8］，本实验通过应用丝裂原激活的蛋白激酶激酶（mitogen activated protein kinases kinases，MAPKK/MEK）的特异性阻滞剂PD98059孵育大鼠NSC，探讨该通路在NSC中的作用，为确定NSC增殖、分化的调控靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

TC2323型CO2培养箱（美国Sheldon公司）、CX-RFL-2落射荧光显微镜（日本Olympus公司）、LEICADMIL倒置生物显微镜（德国LEICA公司）、ELX-800全自动酶标仪（美国BIO-TEK公司）、SDSPAGE蛋白电泳仪和蛋白转膜仪（上海天能公司）。培养NSC所用动物为准确胎龄的Wistar孕鼠，购于重庆医科大学实验动物中心。DMEM/F-12、B27、HBSS液、胎牛血清购于美国Gibco公司；EGF、bFGF购于美国Sigma公司；LY294002购于美国Promega公司；Cell Counting Kit-8试剂盒购于日本同仁公司；多聚赖氨酸、兔抗大鼠Nestin、小鼠抗大鼠BrdU、兔抗大鼠β-tubulin-Ⅲ、FITC标记的山羊抗小鼠IgG、TRITC标记的山羊抗兔IgG等均购于美国Santa Cruz公司。BCAProtein Kit（HyClone-Pierce公司）；Prestained protein marker（中晶公司）；ECL-PLUS/Kit（Amersham 公司）；兔抗P44/42MAPK（ERK1/2）多克隆抗体、小鼠 Phospho-P44/42MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）多克隆抗体、羊抗小鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP（Cell Signaling Technology公司）。

1.2 方法

1.2.1 NSC的分离、培养：无菌条件下取E15-16大鼠胎鼠全脑，保留嗅脑，去除小脑，用组织分离液（DHank）冲洗干净。仔细剥离血管和脑膜，剪碎，加0.25%胰酶37℃消化10～20min，500g离心5min，去除上清液，加入NSC培养基（DMEM/F12+2%B27+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF），吹打成为单细胞悬液，按照2×106/ml的比例接种于塑料培养瓶，置于 37℃、5%CO2、80%湿度（HR）条件下 CO2培养箱中悬浮培养。隔2～3d换半量培养液1次。

1.2.2 NSC的Nestin鉴定：取原代培养和传代培养的神经球滴在涂布0.1%多聚赖氨酸的无菌盖玻片上，37℃、5%CO2、80%湿度（HR）培养箱孵育2d后，取出盖玻片用0.01mol/LPBS（pH7.2）洗涤，行Nestin细胞免疫组化鉴定，兔抗Nestin的浓度为1∶400。

1.2.3 经PD98059孵育后NSCWST-8检测：用不同浓度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC12h后用Cell Counting Kit-8试剂盒做WST-8检测，通过OD值了解PD98059对NSC存活的影响。

1.2.4 经PD98059孵育后NSCBrdU鉴定：将BrdU溶于无血清培养液，BrdU终浓度为5μmol/L，然后用不同浓度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC5d后，吸出细胞球滴在涂布10%多聚赖氨酸的无菌盖玻片上，2d后做BrdU免疫组化鉴定，其中小鼠抗BrdU的浓度为1∶400。

1.2.5 经PD98059孵育后 NSCβ-tubulin-Ⅲ鉴定：用不同浓度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC2d后，吸出细胞球滴在涂布10%多聚赖氨酸的无菌盖玻片上，加入含10%FBS的DMEM/F12诱导分化，14d后做β-tubulin-Ⅲ免疫组化鉴定，兔抗大鼠βtubulin-Ⅲ的浓度为1∶400。

1.2.6 经PD98059孵育后NSCWestern blot检测：用不同浓度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC60min后做Western blot检测。用0.01mol/LPBS洗涤细胞后，加入适量预冷的含蛋白酶抑制剂（PI）1×Lysis buffer裂解细胞，超声破碎仪破碎细胞后取上清，采用BCAProtein Assay Kit测蛋白浓度后，每个样品均调整为 2μg/μl的蛋白终浓度，每孔上样 20μl后进行SDS-PAGE电泳，电流强度为15mA，电泳2h。电泳结束后，进行转膜，电转移的条件设定为恒流400mA，2h。然后将PVDF膜浸泡入5%的脱脂牛奶中，4℃过夜后加入一抗（1∶1000的兔抗P44/42MAPK（ERK1/2）和小鼠 Phospho-P44/42MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）） 室温下孵育 2h，TBST洗膜后加入二抗（1∶5000的辣根过氧化物酶驴抗兔/小鼠IgG）室温下孵育2h，TBST和TBS洗膜后进行ECL显色反应、曝光、显影、过水、定影。

1.3 统计学处理

计算染色后BrdU、β-tubulin-Ⅲ阳性细胞的数目。每个处理组做3张染片，每张染片随机计数10个非重叠视野（×200）下的阳性细胞数，数据用±s表示，用SPSS13.0软件进行方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSC的培养及鉴定

自E15-16大鼠胎鼠大脑所得的细胞呈圆形，大小近似，细胞存活率80%～90%，呈悬浮生长，分裂的细胞逐渐形成细胞团，折光性强，边界清楚（图1），经免疫组化染色，NSC标记性蛋白Nestin在原代及传代培养的神经球均有表达（图2）。胞质及突起着色，表明分离培养的神经球具有胚胎源性。提示所分离培养的细胞是NSC。

2.2 经PD98059孵育后的NSCWST-8检测结果

在 PD98059高浓度（12.5mmol/L、15.0mmol/L、17.5mmol/L、20.0mmol/L）时对NSC存活的影响与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），说明MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路在NSC的存活中起重要作用。见表1。

表1NSC经不同浓度PD98059孵育后的OD值（450n m/630n m）、Br d U和β-t u b u l i n-Ⅲ阳性细胞数比较（±s）Ta b.1Th e c o mp a r i s o n o f ODv a l u e（450n m/630n m），Br d U-p o s i t i v e c e l l s a n d β-t u b u l i n-Ⅲ p o s i t i v ec e l l s o f NSCa f t e r i n c u b a te d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f PD98059f o r 12h（±s）Group ODvalue BrdUpositive cells β-tubulin-Ⅲ positive cells Control group（0mmol/L） 1.781±0.027 36.33±5.529 3.33±1.1552.5mmol/Lgroup 1.741±0.057 34.13±5.257 2.97±1.2175.0mmol/Lgroup 1.702±0.086 33.97±3.899 3.00±1.0837.5mmol/Lgroup 1.707±0.047 33.83±4.617 2.83±1.08510.0mmol/Lgroup 1.593±0.166 33.43±5.835 2.80±1.18612.5mmol/Lgroup 1.508±0.1011） 33.77±4.1581） 2.77±1.16515.0mmol/Lgroup 1.393±0.1051） 34.40±4.2481） 2.73±1.31117.5mmol/Lgroup 1.173±0.1521） 33.33±4.1801） 2.70±1.1191）20.0mmol/Lgroup 0.991±0.1192） 32.53±5.8001） 2.63±1.0981）1）P<0.05vs control group；2）P<0.01vs control group

2.3 经PD98059孵育后NSC的BrdU阳性细胞结果

在 PD98059的 12.5mmol/L、15.0mmol/L、17.5mmol/L、20.0mmol/L组中BrdU阳性细胞与正常对照组比较下降，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.4 经PD98059孵育后NSCβ-tubulin-Ⅲ阳性细胞结果

当 PD98059浓度为 17.5mmol/L、20.0mmol/L时，β-tubulin-Ⅲ阳性细胞数少于正常对照组，具有统计学意义（P<0.05）（表1），并且可见突触短小发育不良的神经元（图3、图4）。

2.5 经PD98059孵育后NSC的Western blot检测结果

从Western blot检测结果可以看出PD98059对磷酸化的丝裂原激活的蛋白激酶（细胞外信号调控激酶）P44/42MAPK（ERK1/2）的抑制作用呈剂量依赖性的（图 5），说明PD98059对MAPKK/MEKMAPK/ERK信号通路的阻断作用呈剂量依赖关系。

3 讨论

目前已知，MAPK采用高度保守的三级激酶级联传递信号，按激活顺序为丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶（MAPKK）-MAPKK-MAPK，它们构成了一个连续的激活途径。

MAPK信号级联通路能将由表面受体介导的细胞外信号传导到细胞核内部，作为最重要的下游组件的ERK1和ERK2，是唯一能在细胞质和细胞核之间穿梭往返的组件。现己证实在MAPK级联通路中，在接受细胞外信号刺激后，细胞外信号调控激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是唯一能在核中聚集的物质，主要调节细胞的生长和分化。PD98059是MAPKK/MEK的特异性阻滞剂，在本实验中，低浓度的PD98059对NSC的存活、增殖和分化没有明显影响，但是经较高浓度的PD98059孵育后，NSC的存活、增殖和分化受到明显抑制，说明PD98059对MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路的阻断作用呈剂量依赖关系，本实验表明在大鼠NSC中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路对其多种生理功能起重要作用，MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路维持正常是大鼠NSC存活、增殖和分化的必要条件。

目前已知MAPK广泛分布于整个中枢神经系统中。各种细胞外刺激信号，包括神经递质、神经营养因子、生长因子等均可通过这一通路影响突触传递、神经元的重塑、形态分化和生存等，从而参与神经系统多种疾病的病理过程。神经营养因子和其他刺激神经的化学物质可以激活ERK信号通路，活化的ERK参与神经细胞的存活、分化及神经元结构和功能的可塑性调节［3，9～11］。目前已知转录因子活化剂蛋白 1（activator protein-1，AP-1）如糖原合成激酶 3（glycogen synthesis kinase 3，GSK3）［12］及 Bcl-2，BAD，cAMP反应元件结合蛋白（cAMPresponse element binding protein，CREB）和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）均是 MAPKK/MEK-MAPK/ERK通路的下游靶点，它们在神经元的发育、存活和维持神经元的长期可塑性上发挥重要作用［3，9～12］。

目前许多学者认为一些神经因子或促神经发生的药物是通过MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路来影响其下游许多信号分子的表达，如果要探究它们是否是通过MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路调节相关的信号分子，就需要先用MAPKK/MEK的特异性阻滞剂来孵育细胞然后再用因子或药物来诱导细胞，所以确定NSC中既能抑制ERK的激活又不会影响细胞存活的MAPKK/MEK的特异性阻滞剂的浓度至关重要，因为如果MAPKK/MEK的特异性阻滞剂的浓度过高就会导致细胞死亡，就不会对后面的因子或药物产生反应，如果MAPKK/MEK的特异性阻滞剂的浓度过低就不会有效抑制MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路，就不会探明相关信号分子是否是MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路的下游信号。从本实验结果可以得知:在NSC中，MAPKK/MEK的特异性阻滞剂PD98059为10～12.5mmol/L时既能有效抑制ERK的激活，又不会影响细胞存活，该浓度可以作为有效阻滞NSC中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路的阻滞剂浓度。

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（编辑 武玉欣，英文编辑 郑华川）

Effect of MAPKK/MEK-MAPK/ERKSignal Transduction Pathway in Rat Neural Stem Cells

ZHAOYu1，XIEPeng1，ZHUXiao-feng2，CAIZhi-you1
（1.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.The Neuroscience Research Institute of Jiamusi University，Jiamusi 154007，China）

ObjectiveTo incubate the rat neural stem cells with specific inhibitor（PD98059）of MAPKK/MEKto clarify the effect of MAPKK/MEK-MAPK/ERKsignaling pathway in neural stem cells（NSC）.MethodsNSCs derived from E15-16rats were isolated and cultured.After treated with different concentration of PD98059，they were subjected to the detection of cell proliferation，Nestin，BrdUand βtubulin-IIIby WTS-8assay，immunofluorescent staining or Western Blot respectively.ResultsPD98059had an effect on the survival，proliferation and differentiation of NSCat a concentration-dependent manner.The viability of the NSCwas significantly decreased than the control（P<0.05），whereas the numbers of BrdU-positive and β-tubulin-Ⅲ positive cells were notably fewer than the control（P<0.05）after incubated with the higher concentration of PD98059.The ERKexpression was blocked by PD98059at a concentration-dependent manner.ConclusionThe MAPKK/MEK-MAPK/ERKsignaling pathway played a vital role in the survival，proliferation and differentiation of NSC.

mitogen activated protein kinases kinases；extracellular signal regulated kinase；neural stem cell

R742

A

0258-4646（2010）01-0014-04

高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20050631012）

赵宇（1973-），女，副主任医师，博士.E-mail：wangpang0916@yahoo.com.cn

2009-05-22