王新利，李卿，高婷，付立叶，王扬，蒋涛，姜又红

（中国医科大学 附属第一医院肿瘤研究所第二研究室，沈阳 110001）

树突状细胞分泌的exosomes体外诱导特异性CTL抗肾癌的初步研究

王新利，李卿，高婷，付立叶，王扬，蒋涛，姜又红

（中国医科大学 附属第一医院肿瘤研究所第二研究室，沈阳 110001）

目的 提取树突状细胞外来体（DC）分泌的外来体（exosomes），检测其体外刺激同源T细胞活化和诱导特异性细胞毒性T细胞（CTL）抗肾癌769-P的免疫效应。方法 从健康志愿者外周血单个核细胞中诱导培养DC，流式细胞术检测DC的表型；通过超速离心法结合超滤法制备DC分泌的exosomes，透射电镜观察exosomes的形态，MTT法检测DC分泌的exosomes诱导T细胞的增殖和特异性CTL对769-P的体外杀伤活性。结果 超速离心法结合超滤法能从DC上清中分离exosomes，并且肿瘤抗原致敏DC分泌的exosomes能有效促进T细胞的增殖及特异性CTL抗769-P效应，T细胞增殖倍数达（1.68±0.22）%，CTL杀瘤活性为（38.23±2.16）%。结论 抗原致敏DC分泌的exosomes能有效诱导激活具有较强杀瘤活性的肿瘤特异性CTL。

树突状细胞；外来体；细胞毒性T细胞；肾癌

肾细胞癌简称肾癌，是最常见的肾脏恶性肿瘤，对放化疗均不敏感。研究发现，肾癌有很强的免疫原性，因此免疫治疗成为肾癌的重要辅助治疗手段［1］。树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内功能最强的抗原提呈细胞，用于肿瘤免疫治疗已经取得了一定成果［2］。

外来体（exosomes）是DC分泌的一种直径约30～100nm膜性微囊小体，富含DC的MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子、协同刺激分子等多种生物活性分子，亦在抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。Zitvogel发现，抗原致敏DC来源的exosomes可以在小鼠体内引起抗肿瘤效应［3］，exosomes作为新型亚细胞疫苗的应用前景引起了关注。本研究通过用肾癌细胞冻融抗原致敏DC后，提取DC分泌的exosomes，探讨其体外刺激T细胞活化和诱导细胞毒性T细胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL）抗肾癌细胞769-P的免疫效应。

1 材料与方法

1.1 材料

淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaue）购自天津灏洋生物有限公司；基因重组人GM-CSF购自厦门特宝生物工程有限公司；基因重组人IL-4购自美国PeproTech公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；MTT购自美国Biosharp公司；CD80-FITC，CD86-PE，CD83-APC，HLA-DR-Percp 鼠抗人单克隆抗体购自美国BD公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；100kDa MWCOCentri plus超滤管及1000kDa MWCOCentri plus超滤管购自德国Sartorius公司。肾细胞癌细胞系769-P购自武汉典藏细胞库。

1.2 方法

1.2.1 769 -P肿瘤抗原制备及定量：反复冻融法制备769-P肿瘤抗原，BCA法测定蛋白浓度，0.22μm滤膜过滤，-20℃冻存备用。

1.2.2 DC的诱导培养及表型测定：取10名健康志愿者外周抗凝血20ml，经ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC），PBS洗涤2次，用RPMI1640调整细胞浓度为1×106/ml，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养2h，收集悬浮细胞，-80℃冻存备用；贴壁细胞加入终浓度为800U/ml GM-CSF和500U/ml IL-4继续培养，每3d换液并补加细胞因子，于7d加入冻融抗原100μl诱导DC成熟（记为lyDC），同时设对照组为不加入冻融抗原（记为coDC），继续培养2d。分别收集培养至9d的DC，用流式细胞仪测定表型。

1.2.3 exosomes的提取：采用超速离心法结合膜超滤法提取exosomes，收集培养至9d的DC上清，经0.45μm滤器过滤，将滤过液800g离心30min，收集上清；将其移入1000kDa MWCO50ml超滤离心管中，4℃7500g离心30min，将滤过液移入100kDa MWCO50ml超滤离心管中，4℃7500g离心30min，收集上清液，用PBS在100kDa超滤离心管中4℃7500g离心30min，洗涤2次。得到的浓缩液即为exosomes，0.22μm滤膜过滤除菌，BCA法检测蛋白浓度，-20℃冻存备用。

1.2.4 透射电镜观察下exosomes的形态鉴定：取20μlexosome原液滴于载样铜网上，于室温静置1min；用滤纸从侧面吸干液体，滴加20g/L磷钨酸（pH6.8）约30μl于铜网上，室温负染 1min；用滤纸吸干负染液，在白炽灯下烤干后，于透射电镜下观察并照相。

1.2.5 exosomes对T细胞增殖的影响：将冻存的T细胞于7d复苏培养，9d用于实验。调整T细胞浓度为1×106/ml，每孔100μl接种于96孔培养板中，分别加入 lyDC（DC∶T＝1∶10）、lyDC-exo（10μg/ml）coDC、coDC-exo，对照孔加入等量培养液，每组设3个复孔，置于 37℃，5%CO2培养 5d。每孔加入 20μl MTT（5mg/ml），继续培养 4h，弃上清，每孔加入 200μl二甲基亚砜（DMSO），振荡5min，用酶标仪检测490nm波长OD值，计算刺激指数（SI）。SI=实验组OD值/对照组OD值。

1.2.6 exosomes对T细胞杀瘤活性的影响：调整T细胞浓度为 1×106/ml，将 lyDC（DC∶T＝1∶10）、ly－DC-exo（10μg/ml）、coDC、coDC-exo，与 T细胞混合培养3d，不同刺激组T细胞为效应细胞，对数生长期的769-P为靶细胞，按效靶比为20∶1，接种于96孔板，共孵育24h后，计算杀瘤活性。杀瘤活性＝［杀伤率（%）=［1-﹙实验组OD值-单独效应细胞OD值）/单独靶细胞OD值］×100。1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。所有数据均以±s表示，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 DC表型分析

肿瘤细胞冻融抗原致敏DC后，DC表面成熟标志CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表达明显增加，与未负载组相比有显著性差异（P＜0.01）。（见表1）。提示冻融抗原致敏DC可以诱导DC的成熟。

表1DC表面免疫分子的表达情况（±s，%）Ta b.1Fl o wc y t o me t r y a n a l y s i s o f d e n d r i t i c c e l l s（±s，%）Item CD80 CD83 CD86 HLA-DRlyDC 42.37±2.05 26.05±1.27 39.56±2.14 45.89±1.85coDC 10.26±2.541） 6.69±2.471） 7.56±1.651） 13.27±1.761）1）P ＜ 0.01vs LyDCgroup.

2.2 exosomes的电镜观察

经BCA检测，每107DC产生的exosomes蛋白浓度为1872μg/ml。透射电镜下，exosomes为直径为30～100nm的膜性微囊，圆形或椭圆形，有完整包膜（图 1）。

2.3 exosomes对T细胞的促增殖作用和CTL杀瘤活性的检测

抗原致敏DC及其分泌的exosomes均能刺激T细胞增殖和诱导CTL杀瘤活性，两者相比有统计学差异（P＜0.05），与无抗原致敏组相比均有统计学差异（P＜0.01）；无抗原致敏的DC及其分泌的exosomes不能刺激明显的T细胞增殖和诱导CTL杀瘤活性，两者相比无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2e x o s o me s对T细胞的促增殖作用和诱导CTL杀瘤活性（±s）Ta b.2Pr o l i f e r a t i o no f Tc e l l s a n dc y t o t o x i c i t y o f CTLs i n d u c e db y e x o s o me s（±s）Item Tcell proliferation Cytotoxicity of CTL（%）LyDC 1.95±0.19 53.55±1.10lyDC-Exo 1.68±0.221） 38.23±2.161）coDC 1.12±0.301），2） 10.33±2.081），2）coDC-Exo 1.07±0.271），2），3） 9.49±1.931），2），3）1）P ＜ 0.05vs LyDCgroup；2）P ＜ 0.05vs LyDC-Exo；3）P ＞ 0.05vs CoDC.

3 讨论

DC作为抗原提呈功能最强的一类抗原提呈细胞，是机体免疫应答的始动者，能够显著活化初始T细胞进行增殖［4］。利用DC免疫特性进行肿瘤的生物治疗已成为研究的热点，DC抗肿瘤疫苗在乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌等方面已经取得了初步的进展［5］。然而，在临床应用中仍存在一定的问题［6］，包括体外培养繁琐、长期保存比较困难等问题。

exosomes可由多种细胞分泌［7］，是细胞内多泡体（multivesicular bodies，MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种膜性囊泡［8］。DC来源的exosomes携带DC的功能蛋白并且理化性质稳定，易于保存，在抗肿瘤免疫中具有重要的潜能［9］。本实验通过超速离心结合膜超滤法提取exosomes，直径为30～100nm的膜性微囊结构，与文献报道相符［3］。

本实验显示，无抗原致敏的DC及其分泌的exosomes均不能有效诱导T细胞增殖和CTL杀瘤活性，提示未经活化的DC及其分泌的exosomes性质相同，不能诱导免疫反应；而抗原致敏DC分泌的exosomes能有诱导T细胞增殖和CTL杀瘤活性，比抗原致敏DC诱导作用弱。这可能与exosomes的免疫原性低于DC有关［10］，可以采用一些策略提高exosomes的抗肿瘤效应［11］。虽然目前对于exosomes生物学功能的研究尚处于早期摸索阶段，但不管怎样，DC分泌的exosomes作为一种新型亚细胞结构，因其可有效的诱导CTL的抗肿瘤活性，随着临床标准的制定，相信在肿瘤免疫治疗中可能具有广泛的应用前景。

［1］Bleumer I，Oosterwijk E，DeMulder P，et al.Immunotherapy for renal cell carcinoma［J］.Eur Urol，2003，44﹙1﹚：65-75.

［2］Lin KW，Jacek T，Jacek R.Dendritic cells heterogeneity and its role in cancer immunity［J］.JCancer Res Ther，2006，2﹙2﹚：35-40.

［3］Zitvogel L，Regnault A，Lozier A，et al.Eradication of established murine rumors using a novel cell-free vaccine：dendritic cell derived exosomes［J］.Nat Med，1998，4（5）：594-600.

［4］Rossi M，Yong JW.Human dendritic cells：potent antigen-presenting cells at the crossroads of innate and adaptive immunity［J］.JImmunol，2005，175﹙3﹚：1373-1381.

［5］Passalacqua R，Buti S，Tomasello G，et al.Immunotherapy options in metastatic renal cell cancer：where we are and where we are going［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2006，6﹙10﹚：1459-1472.

［6］Bellone S，Pecorelli S，Cannon MJ，et al.Advances in dendritic-cellbased therapeutic vaccines for cervical cancer［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2007，7﹙10﹚：1473-1486.

［7］Skokos D，Le Panse S，Villa l，et al.Nonspecific Band Tcell-stimulatory activity mediated by mast cells is associated with exosomes［J］.Int Arch Allergy Immunol，2001，124（1）：133-136.

［8］Denzer K，Kleijmeer MJ，Heijnen HF，et al.Exosomes：From internal vesicle of the multivesicular body to intercellular signaling device［J］.JCell Sci，2001，113（19）：3365-3374.

［9］Thery C，Regnault A，Garin J，et al.Molecular characterization of dendritic cell-derived exosomes.Selective accumulation of the heat shock protein hsc73［J］.JCell Biol，1999，147﹙3﹚：599-610.

［10］Hao S，Moyana T，Xiang J.Review：cancer immunotherapy by exosome-based vaccines［J］.Cancer Biother Radiopham，2007，22（5）：692-703.

［11］Hao S，Liu Y，Yuan J，et al.Novel exosome targeted CD4+Tcell vaccine counteracting CD4+25+regulatory Tcell-mediated immune suppression and stimulating efficient central memory CD8+CTLresponses［J］.JImmunol，2007，179（5）：2731-2740.

（编辑 孙宪民，英文编辑 郑华川）

APreliminary Study on Antitumor Effect of Specific Cytotoxic TLymphocytes Activated by Exosomes Secreted from Dendritic Cell Against Renal Carcinoma

WANGXin-li，LIQing，GAOTing，FULi-ye，WANGYang，JIANGTao，JIANGYou-hong
（The Second Laboratory，Cancer Research Institute，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo extract exosomes from dendritic cell（DC）and investigate antitumor effect of the special cytotoxic Tlymphocytes activated by exosomes against 769-P.MethodsMonocytes from peripheral blood of healthy donors were cultured to induce DCin intro and their phenotypes were analyzed by FACS.The exosomes were extracted from DCby ultrafiltration and ultracentrifugation and observed under electric microscope.Proliferation of Tcells and the cytotoxicities of CTLagainst 769-Pinduced by exosome were measured by MTT.ResultsThe exosomes could be separated from culture supernatant of DCby ultrafiltration and ultracentrifugation.The combination of the exosomes from DCand the 769-Pantigen could effectively stimulate Tcell proliferation and enhance their cytotoxicity，the absorption value of Tcell proliferation（1.68±0.22），the cytotoxicity of CTL（38.23±2.16）%.ConclusionThe exosomes extracted by ultrafiltration and ultracentrifugation can present tumor antigen to Tcells and induce the cytotoxicity of CTL.

dendritic cell；exosome；cytotoxic Tlymphocyte；renal carcinoma

R730.51

A

0258-4646（2010）01-0004-03

辽宁省自然科学基金资助项目（20042093）

王新利（1984-），女，硕士研究生.

姜又红，E-mail：jiangyouhong2000@yahoo.com.cn

2009-09-20