夏蒲，徐小燕，贾宝萍，王薇，关一夫，高野康雄，郑华川

（1.中国医科大学 基础医学院生物化学研究室，沈阳 110001；2.中国医科大学 基础医学院病理生理学教研室；3.中国医科大学 档案馆，沈阳 110001；4.日本富山大学 医学部病理诊断教室，日本 富山 930-0194）

胃黏膜特异表达JC病毒T抗原质粒构建及表达鉴定

夏蒲1，徐小燕2，贾宝萍3，王薇2，关一夫1，高野康雄4，郑华川1

（1.中国医科大学 基础医学院生物化学研究室，沈阳 110001；2.中国医科大学 基础医学院病理生理学教研室；3.中国医科大学 档案馆，沈阳 110001；4.日本富山大学 医学部病理诊断教室，日本 富山 930-0194）

目的 利用鼠胃黏膜上皮细胞中高活性的角蛋白19（K19）启动子构建K19-JCVT抗原表达质粒并进行鉴定。方法 利用PCR方法突变JC病毒T抗原中的NdeⅠ位点，并在两端插入BclⅠ位点，通过BamHⅠ位点将DNA片段与K19启动子连接，构建K19-JCVT抗原质粒。利用酶切和DNA测序确认其DNA序列。免疫组化筛选细胞角蛋白19阳性胃癌细胞，对细胞角蛋白19表达阳性的胃癌细胞系AGS进行K19-JCVT抗原质粒转染，用Western blot方法检测JCVT抗原的表达情况。结果K19-JCVT抗原表达质粒成功构建，AGS胃癌细胞系高表达细胞角蛋白19并用于K19-JCVT抗原表达质粒转染，转染K19-T抗原质粒的AGS细胞系有T抗原表达。结论 同义突变和相似连接在质粒构建中起到关键作用，酶切位点的甲基化也是值得注意的问题。

JC病毒；T抗原；真核表达；载体构建

JC病毒（John Cunningham virus，JCV）是多瘤病毒家族成员之一，人体和动物实验证明其与恶性肿瘤发生关系密切［1～4］。本研究小组成员利用巢式PCR和Southern杂交方法检测JCV，结果发现胃癌中存在JCVT抗原基因，实时PCR检测结果表明胃癌中JCV拷贝数显著高于正常胃黏膜，原位PCR证实JCVT抗原存在于胃癌细胞核中，提示JCVT抗原可能参与胃黏膜上皮细胞恶变［5］。日本学者利用胃黏膜上皮细胞中高活性的角蛋白19（keratin 19，K19）启动子成功建立了胃癌转基因动物模型，为胃癌研究人员提供了方便快捷的胃肿瘤动物模型［6］。本研究通过构建能够在含K19启动子的胃黏膜中特异表达的JCV抗原表达质粒，为转基因小鼠及胃癌动物模型的建立提供稳定、可靠的分子工具。

1 材料与方法

1.1 构建pBSK-T抗原质粒

设计引物 P1和 P4、P2和 P3，以 pBSK-JCVmad1质粒为模板选用具有高保真性能的pfu DNA polymerase进行PCR扩增。通过同义突变，将NdeⅠ的酶切位点CCATATGCA突变成SplⅠ酶切位点CCGTACGCA。其中脯氨酸CCA同义突变成脯氨酸CCG，酪氨酸TAT同义突变成酪氨酸TAC。反应条件为：94℃预变性 3min；94℃ 45s，65℃ 45s，72℃ 60s，共30个循环。将所得PCR产物用BKL试剂盒进行磷酸化，通过HincⅡ位点酶切并去磷酸化后与pBSK质粒连接，构建的质粒命名为pBSK-P1-P4和pBSK-P2-P3。然后将pBSK-P1-P4和pBSK-P2-P3分别用XhoⅠ和SplⅠ进行双酶切。将酶切产物进行连接，构建pBSK-T抗原质粒。用HincⅡ/HindⅢ对连接的质粒进行鉴定（图1）。

1.2 构建K19-JCVT抗原表达质粒

将pBSK-T抗原质粒先用scs110进行转化，然后扩增及纯化，再用BclⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。将Cox2片段用BamHⅠ从K19-Cox2质粒切下来，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收余下的K19载体。由于BclⅠ和BamHⅠ有相同的黏末端，所以酶切后可进行连接，构建质粒K19-T抗原。NdeⅠ和BamHⅠ酶切鉴定重组体，测序鉴定T抗原基因插入的方向及DNA序列，插入方向正确的重组体记为K19-T抗原质粒，设计引物进行测序鉴定。

1.3 细胞培养

在37℃、5%CO2和含10%胎牛血清培养液的条件下培养胃癌细胞系，MKN28（高分化腺癌）、MKN45（低分化腺癌）和KATO-Ⅲ（印戒细胞癌）在RPMI1640培养液里进行培养，HGC-27（未分化腺癌）在MEM培养液中进行培养，而AGS（中分化腺癌）在Ham F12培养液中进行培养。

1.4 免疫组化

所有细胞离心收集并用PBS缓冲液洗后固定在10%的福尔马林中，常规方法制作成石蜡标本，并切成4μm切片。石蜡切片脱蜡至水化并用TRS（DAKO，Carpinteria CA93013，USA）进行抗原修复，5%胎牛血清封闭5min阻断非特异性结合，抗人-细胞角蛋白 19一抗（Neomarker；1∶100）孵育 15min，抗鼠IgG-HRP二抗孵育（DAKO，即用型）15min，最后进行DAB显色、苏木精复染和封片，孵育和DAB显色在间歇微波照射中进行，孵育后用TBST洗去非特异性结合，去除一抗作为阴性对照。

1.5 细胞转染和Western印迹杂交

筛选细胞角蛋白19（cytokeratin 19）表达阳性的细胞进行K19-T抗原转染。依据Effectene（QIAGEN）产品说明，将K19-JCVT抗原表达质粒转染到AGS胃癌细胞系中，pEGFP-N1作为阳性对照检测转染体系。利用RIPA裂解液［50mmol/LTris-HCl（pH7.5），150mmol/LNaCl，5mmol/LEDTA，0.5%Nonidet P-40，5mmol/Ldithiothreitol，10mmol/LNaF，protease inhibitor cocktail（Sigma）］和超声粉碎提取细胞总蛋白。利用BCA试剂盒（Pierce）蛋白定量后取100μg蛋白样品经10%的SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移到Hybond膜（Amersham）上，用5%脱脂奶粉/0.1%Tween20/TBS（TTBS）室温封闭膜 1h，一抗用兔SV40T抗原（抗SV40T抗原抗体与JCVT抗原可交叉反应；Santa Cruz；1∶500） 孵育 1h，TTBS洗3次，加入辣根酶标记的羊抗兔-IgG（DAKO；1∶1000）于室温孵育 1h，ECL显色（Santa Cruz），富士LAS2000检测阳性信号。

2 结果

2.1 pBSK-T抗原质粒构建与鉴定

JCVT抗原PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，磷酸化后插入pBSK的多克隆位点。通过XhoⅠ和SplⅠ进行双酶切将分割JCVT抗原连接，突变NdeⅠ为SplⅠ，两端加入BclⅠ位点。用HincII/HindIII双酶切pBSK-JCVT抗原质粒，所得3条DNA片段符合预期片段（图2），测序鉴定了插入基因的正确性。

2.2 K19-T抗原质粒构建与鉴定

将构建的pBSK-JCVT抗原质粒转入SCS110感受态细胞后，提取DNA并进行BclⅠ酶切，与K19-COX-2质粒BamHⅠ酶切片断连接，利用NdeⅠ和BamHⅠ酶切鉴定。构建的K19-T抗原质粒用NdeⅠ酶切电泳，可见到2条DNA条带，用BamHⅠ酶切电泳，可见到1条DNA条带，利用两酶联合切割，可得到3条带，与预期结果一致（图3）。设计引物后，进行测序。结果发现突变位点和JCVT抗原两端序列完全正确（图4）。

2.3 细胞角蛋白19蛋白表达筛选及K19-JCVT抗原表达质粒转染表达

细胞角蛋白 19在 AGS、MKN28、MKN45、KATOⅢ、HGC-27细胞系中都是阳性表达（图5）。细胞角蛋白19的启动子是K19，所以细胞角蛋白19阳性表达的细胞可以激活K19启动子。以pEGFP-N1为内参将K19-T抗原表达质粒转染至AGS细胞系。Western blot结果显示，实验组中存在大T抗原（分子量为94kDa）的表达，而对照组中未出现（图5）。

3 讨论

JC病毒（还包括SV40和BK病毒）基因组为环状闭合双链DNA（约5.2kb），含有T抗原、VP和agnoprotein3个主要基因。T抗原为早期编码基因，通过选择性剪接可形成大T和小t抗原。大T抗原具有ATP酶、解旋酶和聚合酶活性，在病毒基因组复制中发挥重要作用。agnoprotein为一个小调节蛋白编码基因［1，2］。

JCV中起关键致癌作用的大T抗原可与抑癌基因pRb和p53编码蛋白结合而使其丧失对细胞周期和凋亡的调节，抑制Wnt信号传导途径进而促进β-链接素核移动和癌基因c-myc蛋白表达，可上调胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）和胰岛素样生长因子1型受体（insulin-like growth factor-1receptors，IGF-1R）表达及磷酸化来促进细胞增殖，通过与AP-1转录因子结合而扰乱正常细胞生命活动［3～5］。总之，T抗原在JCV致癌的生物学过程中发挥重要作用。

由于K19-Cox-2质粒启动子两侧有NdeⅠ酶切位点，所以设计PCR引物的时候，将T抗原中的脯氨酸CCA同义突变成脯氨酸CCG，酪氨酸TAT同义突变成酪氨酸TAC，进而将NdeⅠ酶切位点突变成BclⅠ。然后可以在构建好的pBSK-T抗原质粒中利用BclⅠ酶切下T抗原后插入K19质粒中。

SCS110是endA-衍生的JM110菌株。SCS110为质粒或噬菌体DNA的制备提供理想场所，使质粒或噬菌体DNA免于Dam或者Dcm甲基化，因此1个或多个甲基化敏感的限制性内切酶可以切割DNA［7］。实验中使用的BclⅠ是甲基化敏感的限制性内切酶，构建的pBSK-T抗原质粒在用SCS110转化后，可以被BclⅠ酶切下来，进而可以继续下一步连接反应。在本实验中曾经用DH5α对质粒进行转化，但是扩增的质粒无法用BclⅠ进行切割及连接。

本实验选用的Stratagene的Pfu酶是一种热稳定性DNA聚合酶，从携带Pyrococcus furiosus的pol基因的大肠杆菌中分离得到［8，9］。该酶具有 3′到 5′校读外切酶活性，催化DNA合成，并且错误率极低。Pfu是目前已发现的所有聚合酶里面保真度最高的聚合酶。我们在实验中曾经使用其他的DNA聚合酶，都没有达到预期的效果。

建立在胃组织特异细胞中表达的JCVT抗原基因真核表达载体，将为转基因小鼠及胃癌动物模型的建立提供稳定、可靠的分子工具。胃癌是消化道恶性肿瘤中最多见的癌种，死亡率居恶性肿瘤之首位，建立胃癌肿瘤动物模型可为胃癌的早期诊断、治疗和发病机制的研究提供非常有用的实验动物模型。

［1］Zheng HC，Yan L，Cui L，et al.Mapping the history and current situation of research on John Cunningham virus-a bibliometric analysis［J］.BMCInfect Dis，2009，9（1）：28.

［2］Zheng H，Murai Y，Hong M，et al.JCvirus detection in human tissue specimens［J］.JClin Pathol，2007，60（7）：787-793.

［3］Kutsuna T，Zheng H，Abdel-Aziz HO，et al.High JCvirus load in tongue carcinomas may be a risk factor for tongue tumorigenesis［J］.Virchows Arch，2008，452（4）：405-410.

［4］Zheng H，Abdel-Aziz HO，Nakanishi Y，et al.Oncogenic role of JCvirus in lung cancer［J］.JPathol，2007，212（3）：306-315.

［5］Murai Y，Zheng HC，Abdel-Aziz HO，et al.High JCvirus load in gastric cancer and adjacent non-cancerous mucosa ［J］.Cancer Sci，2007，98（1）：25-31.

［6］Oshima H，Oshima M，Inaba K，et al.Hyperplastic gastric tumors induced by activated macrophages in COX-2/mPGES-1transgenic mice［J］.EMBOJ，2004，23（7）：1669-1678.

［7］Kawachi R，Koike Y，Watanabe Y，et al.Development of a genetic system in chitinase-producing streptomyces and the application of an allosamidin-insensitive chitinase gene to homologous overexpression［J］.Mol Biotechnol，2004，26（3）：179-186.

［8］Mitra S，Shrppard G，Wang J，et al.Analyzing the binding of Co（II）-specific inhibitors to the methionyl aminopeptidases from Escherichia coli and Pyrococcus furiosus ［J］.JBiol Inorg Chem，2009，14（4）：573-585.

［9］Kaistha SD，Sinha R.Homology modeling of phosphoryl thymidine kinase of enterohemorrhagic Escherichia coli OH：157［J］.Bioinformation，2009，3（6）：240-243.

（编辑 武玉欣，英文编辑 郑华川）

The Construction and Expression Confirmation of JCVirus TAntigen Expression Plasmid in Gastric Mucosa

XIAPu1，XUXiao-yan2，JIABao-ping3，WANGWei2，GUANYi-fu1，TAKANOYasuo4，ZHENGHua-chuan1
（1.Department of Biochemistry and Molecular Biology；2.Department of Pathopysiology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.The Archives，China Medical University，Shenyang 110001，China；4.Department of Diagnostic Pathology，School of Medicine，U－niversity of Toyama，Sugitani 930-0194，Japan）

ObjectiveTo construct and confirm the JCvirus（JCV）Tantigen expression plasmid using mouse keratin 19（K19）promoter specific for the gastric epithelial cells.MethodsThe NdeIsite was mutated by PCRwith BclIinsertion at both sides.The DNAfragment digested by BclⅠ was ligated with the plasmid containing K19promoter via BamⅠ site.The DNAsequence was confirmed by restriction enzyme digestion and direct DNAsequencing.Cytokeratin 19protein was examined to screen gastric carcinoma cell for transfection of K19-JCVTantigen expression plasmid by immunohistochemistry.The Western blot was employed to detect the JCVTantigen expression in the gastric carcinoma transfectant.ResultsK19-JCVTantigen expressing plasmid was successfully constructed.The AGSstrongly expressed cytokeratin 19protein and was selected for the transfection of K19-JCVTantigen expressing plasmid.JCVTantigen was positively expressed in the AGStransfectant.ConclusionThe synonymous mutation and compatible ligation are useful in the plasmid construction.The methylation of restriction enzyme should be considered.It is meaning for the transgenic animal model of gastric carcinoma to successfully construct the JCvirus Tantigen expression plasmid in gastric mucosa.

JCvirus；Tantigen；eukaryotic expression；vector construction

R731

A

0258-4646（2010）01-0018-04

沈阳人才资源开发基金项目；辽宁省百千万人才工程资助项目；教育部归国人员科研启动基金项目；人事部留学人员科技活动择优资助项目；2009年沈阳市科学技术计划资助项目（1091175-1-00）

夏蒲（1982-）男，硕士研究生.

郑华川，E-mail：zheng_huachuan@hotmail.com

2009-05-22