马信龙，张华峰，马剑雄，孙智超，王志钢，张园，王晨光，杨阳

天津医科大学总医院骨科(天津300052)

1957年Pietrogrande和Mastromarino首先报道了第1例使用糖皮质激素引起股骨头坏死的病例。激素是继外伤之后引起股骨头坏死的第二大原因，约占股骨头坏死的3%～38%，约25%的激素治疗的患者会发生骨坏死。本研究从生物力学因素，探究大鼠激素性股骨头坏死的发病机理。

1 材料和方法

1.1 动物分组和造模4月龄健康Wistar大白鼠40只，雌雄各半，适应性喂养1周后随机分成两组：实验组和对照组各20只。精确称重后，分别臀肌注射地塞米松磷酸钠（20 mg/kg），每周1次，共计8周。实验组置于跑步机中，以1 km/h速度匀速跑动，每次30 min，每周2次。跑动后，正常笼中饲养，自由进食饮水。对照组生理状态下正常负重，正常笼中饲养，自由进食饮水。两组均于肌肉注射药物后2、4、6、8周处死，每组每次各5只。

1.2 HE染色取大白鼠左侧股骨头，去除股骨头周围软组织后置入4%多聚甲醛固定液，固定24 h。取大白鼠双侧股骨头，尽量去除股骨头周围软组织后置入10%中性甲醛固定液，固定24 h。30%甲酸脱钙3 d，脱钙完全后，流水冲洗。梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理2 h，石蜡包埋。制成4μm厚切片，常规HE染色，用双目Olympus光学显微镜分别在40×、100×、400×下观察。

1.3 生物力学测试（1）取大鼠右侧股骨，去除股骨头周围软组织。（2）以生理盐水浸透纱布，包裹标本，置于-30℃速冻，直至测量。（3）解冻至室温，以生理盐水喷涂，保持标本湿润。（4）以90“L”形有机塑料板固定大鼠股骨，使股骨大转子外侧、内侧髁和外侧髁远端面、分别贴附于有机塑料板，以黏合剂黏合。（5）“L”形塑料板固定好的股骨标本，装入以1 cm×1 cm为底、高略小于股骨干长度的卡具，灌入快速自凝牙托粉和牙托水以50 mg:40 mL的比例反应成聚甲基丙烯酸甲酯（poly methylmethacrylate，PMMA），至股骨头下方。（6）采用ElectroForce 3 200生物力学材料动态力学性能测试系统，将包埋好的大鼠股骨标本固定到圆盘上，保证其标本固定中心与圆盘中心一致。（7）在WinTest软件中，使得Load数值在零点附近，然后仪器数值归零，压力平台以10μm/0.2 s速度下压股骨头，压力感受器记录范围0～220 N，每0.2 s，软件自动记录下累计时间（Elapsed Time）、扫描时间（Scan Time）、位移（Disp,μm）、负荷（Load,N）、轴向理论位移（Axial cmd，μm）。（8）根据位移，负荷，拟合形变—压力曲线，分析股骨头刚度、最大形变和压缩能量吸收。

1.4 统计学分析应用SPSS 13.0统计学软件进行数据统计学处理，结果以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用两样本均数比较的t检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 组织病理学观察正常组织可见：（1）骨小梁结构清晰，排列规则整齐，致密饱满。（2）骨小梁陷窝内可见大量骨细胞，骨细胞清晰可见，核较大，位于中央，偶可见空骨陷窝。（3）骨髓腔增生活跃，细胞分布均匀，造血细胞丰富，脂肪细胞与造血细胞比例正常；网状纤维无断裂现象，骨髓腔内血管分布均匀，未见血管出血，偶见巨噬细胞。

对照组：2周可见，骨小梁结构基本正常，单位面积内骨小梁体积正常，排列规整；骨细胞核紧靠一侧骨陷窝壁，固缩，深染，空骨陷窝轻度增多；髓腔内脂肪细胞轻度增生，体积增大，造血组织轻度减少，见图1。6周可见：骨小梁变细明显，结构轻度紊乱，尚未见小梁断裂现象；空骨陷窝进一步增多；骨髓腔内脂肪细胞增多，增大明显，出现骨髓水肿，见图2。8周可见：骨小梁单位面积内体积明显减少，偶见断裂现象，骨细胞排列杂乱，见图3。

实验组：2周可见，骨小梁较正常变细，单位面积内骨小梁体积减少，排列较规整；骨细胞核紧贴一侧骨陷窝壁，固缩，深染，空骨陷窝轻度增多；随腔内脂肪细胞轻度增生，体积增大，造血组织轻度减少，见图4。6周可见：骨小梁变细，间距略增大，体积略减少，结构紊乱，偶见小梁断裂现象，骨细胞排列轻度杂乱；骨细胞变性增多，空骨陷窝增多明显；骨髓腔内脂肪细胞增多，骨髓水肿。见图5。8周可见：小梁断裂现象和游离骨，骨细胞排列杂乱；空骨陷窝进一步增多；骨髓腔内出现脂肪细胞互相融合，造血细胞减少明显，骨髓水肿面积增大，见图6。

2.2 生物力学测定以WinTest软件，每0.2 s自动记录如下参数：s、μm、N。根据位移、负荷，用Origin 7.0，拟合形变—压力曲线，以y=kx+b形式表示，斜率k即为股骨头刚度（N/μm），曲线下面积即为股骨头在该压缩过程中吸收能量（N·μm），上述参数均可由Origin求得。记录下纵向最大形变、刚度和压缩过程能量吸收三个参数。

2.2.1 纵向最大形变测量股骨头纵向最大形变实验组对比对照组，自第4周起有明显统计学差异（P＜0.05），随着负重时间的延长，实验组纵向最大形变大于同时期对照组。见表1和图7。

2.2.2 刚度测量由形变—负荷曲线斜率，可得股骨头刚度。股骨头刚度实验组对比对照组，自第2周起有明显统计学差异（P＜0.05）。随负重时间的延长，实验组刚度小于同时期对照组，刚度下降明显。见表2和图8。

图1 对照组2周，骨小梁结构基本正常，骨小梁体积正常，排列规整(HE×100)

图2 对照组6周，骨小梁变细明显，间距增大，结构轻度紊乱，未见小梁断裂现象(HE×100)

图3 对照组8周，偶见骨小梁断裂现象，较多的空泡陷窝(HE×100)

图4 实验组2周，骨小梁较正常变细，骨小梁体积减少，排列较规整(HE×100)

图5 实验组6周，骨小梁变细明显，结构紊乱，可见小梁断裂现象(HE×100)

图6 实验组8周，大范围骨小梁断裂现象，出现游离骨(HE×100)

表1 纵向最大形变实验组与对照组t检验(±s,n=20)

表1 纵向最大形变实验组与对照组t检验(±s,n=20)

注：对照组同时点相比较，*P<0.05

2周4周6周8周对照组245.8±31.0 355.4±29.2 533.4±75.0 646.0±112.8实验组304.4±40.6 434.0±42.3*565.4±40.2*832.6±60.5*

表2 刚度测量结果t检验(±s,n=20)

表2 刚度测量结果t检验(±s,n=20)

注：与对照组同时点相比较，*P<0.05

2周4周6周8周对照组0.89±0.14 0.63±0.07 0.42±0.08 0.35±0.05实验组0.74±0.11*0.50±0.06*0.38±0.03*0.27±0.01*

图7 激素性股骨头坏死中压缩股骨头最大形变

2.2.3 压缩过程能量吸收测量 股骨头压缩过程能量吸收实验组对比对照组，自第2周起有明显统计学差异（P＜0.05）。随着负重时间的延长，实验组能量吸收大于同时期对照组，能量吸收增加明显有统计学意义（P＜0.05）。见表3和图9。

图8 激素性股骨头坏死股骨头刚度曲线

图9 激素性股骨头坏死中股骨头压缩过程能量吸收

表3 压缩过程能量吸测量结果t检验(±s,n=20)

表3 压缩过程能量吸测量结果t检验(±s,n=20)

注：与对照组同时点相比较，P<0.05

2周4周6周8周对照组26 415.09±2 155.88 41 628.80±1 479.67 58 523.35±709.63 74 090.84±6 790.42实验组35 334.82±2 547.60 47 335.18±743.54 62 842.68±2 313.63 100 082.62±8 554.9

3 讨论

骨的基本代谢过程是塑形和重建。一般来说，塑形主要通过增加骨外周直径、骨皮质以及骨小梁的厚度来增加骨强度[1-2]。骨代谢主要受生物力学因素的影响和制约，而且在骨组织的重建和塑形过程，是以其载荷能力足够适应外力环境为结果的。

反复的应力改变会使骨发生细微损伤，骨重建过程可以修复有限数量的细微损伤。当骨所发生的应变超出阈值的时候，将产生过多的细微损伤，并超出骨自身的修复能力。这种细微损伤的积累使骨的脆性增加，在有害应力下发生骨折的可能性增加[3]，比如股骨头无菌性坏死软骨下骨的塌陷。

大量实验证明，长期使用激素会导致明显的骨质疏松。在本实验中，实验组单位视野下骨小梁面积，骨小梁宽度较对照组明显减少。在力学测试中可以发现，随着负重时间的增加，股骨头的刚度、最大位移，以及在该过程中吸收的能量在实验组和对照组之间同样均有统计学意义（P＜0.05），表明在激素的作用下随着负重的增加，股骨头的刚度在逐渐下降，抗应力的能力在随之下降。

在实验中，我们不难看到，随着激素的使用，股骨头从第2周开始，出现明显的骨质疏松，镜下病理观察实验组中股骨头小梁的断裂程度，要高于对照组。即是说，应力因素对于骨小梁的破坏，起到了一个至关重要的作用。

从力学测定结果的角度分析，股骨头的刚度可以直接反映骨质疏松情况，由于力作用的强度恒定（200 N），最大位移和压缩能量吸收成为了另外两个衡量股骨头质量的参数。即是说，当被测骨质在恒定的力作用下，被压缩的形变越大，其骨质质量越差，骨质疏松越严重。由于能量为力对于位移的积分，为负荷—形变曲线下面积，所以压缩能量越大，骨质疏松越严重。我们实验测量结果，最大位移、压缩能量吸收随着激素作用的时间延长而增加，而刚度在逐渐下降，这一结果符合股骨头坏死的骨质疏松特点。我们在进行生理负重和超负重比较的过程中，不难发现，随着负重量的累计，股骨头的刚度下降更为严重，而最大位移和能量吸收也在随之增加，对比正常负重，有统计学意义。这一数据和上述骨小梁面积、宽度基本吻合，即是说，在股骨头坏死过程中，负重情况下，骨小梁的损坏程度更为严重。

在力学测定中，使受力方向和主压力小梁一致，逐渐增大负荷程度，正常的骨组织会有一个弹性形变过程。在实验组中，随着骨质疏松的加剧，以及骨小梁断裂程度的增加，股骨头压缩变为一个不可逆过程，进而刚度等生物力学参数发生一系列变化。在激素性股骨头坏死的发病中，其主要原因是骨质疏松的逐渐加剧，当股骨头负重区不再适应原有应力的强度的时候，骨小梁发生形变，即发生断裂，骨小梁骨折。随着激素和外界应力作用的累计，这些不可逆应变逐渐超过了骨质本身的修复作用，使得骨小梁的断裂骨折成为不可逆过程，进而启动骨细胞凋亡等一系列过程，最终造成股骨头坏死。

本实验结果显示，激素性股骨头坏死和力学因素有密不可分的关系。在该过程中，激素造成股骨头的骨质疏松，骨质的生物力学性能随着激素的使用逐渐下降，当骨质不再适应外界的力学环境的时候，骨小梁会出现逐步的断裂，形成骨小梁骨折，股骨头塌陷，继而骨细胞凋亡，最终出现股骨头坏死。

[1]Frost HM.From Wolff's Law to the Utah paradigm:insights about bone physiology and its clinical applications[J].Anat Rec，2001，262(7):398.

[2]eewss.Integrated bone tissue physiology：anatomy and physiology[M].Bone Mechanics Handbook，2001:1-68.

[3]Reddi AH.Aging，osteoarthritis and transforming growth factorbe⁃ta signaling in cartilage[J].A rthritis Res Ther，2006,8(1):101.