陈敬涵 徐敏 吴恺 王兴鹏

齐留通在急性坏死性胰腺炎腺泡细胞凋亡中的作用

陈敬涵 徐敏 吴恺 王兴鹏

5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase, 5-LOX)是脂肪酸氧化代谢的重要酶类，近年的大量研究已经证实，5-LOX在许多肿瘤的发生和发展中都起到重要作用。而关于急性胰腺炎(AP)时，5-LOX在胰腺腺泡细胞凋亡中作用的研究却鲜有报道。本文旨在探讨5-LOX抑制剂与AP腺泡细胞凋亡的关系和意义。

一、材料和方法

1．实验动物及分组：选用无特殊病原体SPF级雄性SD大鼠54只(由中科院实验动物中心提供)，体重180～240 g，随机分为3组：假手术组、急性坏死性胰腺炎组(ANP组)和齐留通组，每组18只。参照Aho等[1]方法，经胆胰管逆行加压注射5%牛磺胆酸钠溶液(0.1 ml/100 g体重，12 ml/h)建立ANP模型。假手术组注射等容量生理盐水，齐留通组造模前1 h给予齐留通100 mg/kg体重灌胃。于制模后6、12、24 h处死大鼠。

2．观察指标及方法

(1)胰腺组织形态学改变：将各组大鼠胰腺组织的石蜡切片行HE染色，由病理科医师单盲阅片，根据Schmidt等[2]标准进行胰腺组织镜下病理评分。

(2)胰腺细胞凋亡测定：术后各时点取病变较为一致的胰腺头部，固定于4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，常规切片。应用TUNEL法检测胰腺腺泡细胞凋亡，实验步骤按说明书进行，每张切片随即选择5～10个高倍视野，计数1000个腺泡细胞中的凋亡细胞并用百分数表示，作为凋亡指数(AI)。

(3)凋亡相关基因caspase-3、bcl-2的mRNA表达水平测定：术后各时相取胰尾部组织冻存于液氮中备用，以Trizol法提取细胞总RNA，用半定量RT-PCR技术对转录产物进行扩增，以β-actin作为内参对照，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后拍照。用凝胶图像分析系统进行电泳条带密度分析，以靶基因的条带密度/β-actin的条带密度代表靶基因的表达水平。β-actin引物上游5′-TTGTCACCAACTGGGACGATATGG-3′ ，下游5′-CGACCAGAGGCATACAGGGACAAC-3′，扩增长度217 bp；大鼠caspase-3引物上游5′-GAATCCACGAGCAGAGTCAA-3′，下游5′-TAGCCTTCAACAAGCCAACC-3′，扩增长度216 bp；bcl-2引物上游5′-CTTTGCAGAGATGTCCAGTCAG-3′， 下游5′-GTACTCAGTCATCCACAGAGGG-3′，扩增长度208 bp)。

二、结果

1．胰腺组织的病理改变：假手术组各时点胰腺组织结构均正常，细胞形态清晰。ANP组6 h肉眼观胰腺明显肿胀，色暗，少量腹水，呈淡红色，光镜下见腺泡散在的点状坏死，周围聚集许多炎症细胞；12 h胰腺呈暗灰色或黑色，出现较多量的血性腹水，镜下呈片状坏死，大量炎症细胞浸润；24 h腹水量大，镜下见胰腺组织广泛坏死、溶解(图1)。齐留通组6 h见胰腺组织中性粒细胞浸润较ANP 6 h组明显减少，有时可见到点状坏死，12 h镜下有局灶坏死及炎症细胞浸润，但是腺泡结构良好；24 h可见片状坏死及脂肪溶解，但程度较ANP组24 h有所减轻(图1)。齐留通组病理评分均低于ANP相应时点，12、24 h差异有统计学意义(Plt;0.05，表1)。

2．胰腺细胞的凋亡：假手术组极少见到细胞凋亡，ANP组6、12、24 h的凋亡指数分别为(2.33±0.19)%、(4.93±0.33)%、(7.87±0.40)%，均较假手术组高，差异有统计学意义(Plt;0.05)；齐留通组6、12、24 h的凋亡指数分别为(2.42±0.25)%、(10.62±0.60)%、(9.50±0.26)%，均高于相应ANP组，但是两者在6 h的差异无统计学意义，12、24 h均有统计学意义(Plt;0.05，图2)。

表1 各组胰腺组织病理评分

注：与假手术组比较，aPlt;0.05；与ANP相应时点比较，bPlt;0.05

图1ANP组(A、B、C：6、12、24 h)和齐留通组(D、E、F：6、12、24 h)胰腺组织病理改变(HE ×400)

3．caspase-3、bcl-2 mRNA的表达：假手术组胰腺组织有较少的caspase-3、bcl-2 mRNA表达，ANP组各时点表达水平较假手术组均有所升高，且差异有统计学意义(Plt;0.05，表2)；齐留通组各时点caspase-3 mRNA表达水平均高于ANP组，差异有统计学意义(Plt;0.05)，bcl-2 mRNA表达水平均低于ANP组，差异有统计学意义(Plt;0.05，图3，表2)。

图2 各组大鼠胰腺组织腺泡凋亡指数变化

图3ANP组和齐留通组胰腺组织caspase-3、bcl-2 mRNA表达(1、3、5泳道为ANP组6、12、24 h；2、4、6泳道为齐留通组6、12、24 h)

讨论近年的研究证实，白三烯类(LTs)是AP病程中一种重要的炎性介质，而5-LOX是LTs产生的限速酶。近年来大量研究证实， 5-LOX可以抑制癌细胞凋亡[3-6]。

本研究观察ANP大鼠胰腺组织中的细胞凋亡情况及凋亡相关基因caspase-3和bcl-2 mRNA表达水平，以了解在ANP中5-LOX是否影响腺泡细胞的凋亡，从而影响胰腺组织的病理改变。

一直以来都认为在ANP中，腺泡细胞的主要死亡形式是坏死，而凋亡仅仅被认为可以间接地导致器官的萎缩。1995年Kaiser等[7]报道在4种ANP模型中都出现了大量坏死的胰腺细胞，却很少有凋亡细胞，而急性水肿型胰腺炎模型中仅有少量坏死细胞，却有大量凋亡细胞。除此之外，一些研究人员已经证实诱导凋亡可以降低实验性胰腺炎的严重程度[8-9]。Takeyama等[10]报道，胰腺腺泡细胞凋亡在ANP的发病机制及其病程中发挥重要作用，适度的细胞凋亡对ANP时的胰腺腺泡具有保护作用，有目的促进腺泡细胞选择凋亡的方式死亡，而不是以坏死的方式死亡，可以减轻AP的严重程度。这说明ANP严重程度与细胞凋亡呈负相关，腺泡细胞凋亡可能是对胰腺损伤的有利反应，对AP是一个有利的保护性机制。

表2 各组胰腺组织caspase-3、bcl-2 mRNA的表达

注：与假手术组比较，aPlt;0.05；与ANP相应时点比较，bPlt;0.05，cPlt;0.01

本实验结果发现，假手术组极少看到细胞凋亡，ANP组和齐留通组看到明显的细胞凋亡，而且ANP大鼠使用齐留通干预后，每个时点的大鼠胰腺腺泡细胞凋亡都明显多于ANP组，炎症细胞的渗出和细胞坏死也明显减少，胰腺病变减轻。本实验还选取了测定胰腺组织促凋亡基因caspase-3和抑凋亡基因bcl-2的mRNA的表达，结果显示，齐留通组的caspase-3 mRNA表达明显高于ANP组，而bcl-2 mRNA表达明显低于ANP组，提示5-LOX抑制剂齐留通可以通过诱导胰腺腺泡细胞凋亡，进而减少腺泡细胞坏死，减轻胰腺细胞及组织损伤的程度，从而为其成为AP的辅助治疗提供一定的理论依据。

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2008-09-29)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.020

200080 上海，上海市第一人民医院消化内科(陈敬涵、徐敏、吴恺)；上海市第十人民医院(王兴鹏)

徐敏，Email:zhengxu19721973@yahoo.com.cn