王丽华 李兆申 李淑德 杜奕奇 高军 龚燕芳 满晓华 胡先贵

·论著·

甲基转移酶3B基因在胰腺癌中的表达

王丽华 李兆申 李淑德 杜奕奇 高军 龚燕芳 满晓华 胡先贵

目的检测胰腺癌组织中甲基转移酶3B(DNMT3B)基因表达，分析其与胰腺癌临床病理参数的关系。方法应用实时定量PCR和免疫组织化学方法检测42例胰腺癌组织及相应癌旁组织、10例正常胰腺组织中DNMT3B mRNA和蛋白表达。结果胰腺癌组织、癌旁组织和正常胰腺组织DNMT3B mRNA表达量分别为9.4±5.9、1.02±0.71 和0，相差非常显著(Plt;0.05)；DNMT3B蛋白表达阳性率分别为83.3%、14.3%和10.0%，相差也非常显著 (Plt;0.01)。DNMT3B mRNA 表达与临床分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移密切相关(Plt;0.05或Plt;0.01)；DNMT3B蛋白表达与肿瘤的部位、淋巴结转移有关(Plt;0.01或Plt;0.0 5)；DNMT3B mRNA和蛋白表达均与年龄、性别、神经浸润、肿瘤大小、血CEA和CA19-9浓度无关。结论胰腺癌DNMT3B mRNA和蛋白高表达提示胰腺癌已发生淋巴结转移，预后较差。

胰腺肿瘤； 甲基转移酶类； 基因； 实时定量PCR； 免疫组织化学

DNA甲基化是真核生物基因表达调控的一种方式，催化这一过程的是DNA甲基转移酶(DNA-methy1transferases，DNMTs)。DNMTs分为DNMT1、DNMT2和DNMT3，DNMT3又分为DNMT3A和DNMT3B。Benbrahim-Tallaa等[1]报道，DNMT3B的高表达能够导致整体的DNA高甲基化和基因沉默，而DNMT1主要维持这些效应。已有研究报道，DNMT1在胰腺癌中呈高表达，而DNMT3B在胰腺癌发生发展中的作用不详。为此，本实验检测胰腺癌组织DNMT3B mRNA和蛋白表达，分析其与肿瘤病理参数的关系。

材料和方法

一、临床资料

收集2007年8月至2008年7月我院手术治疗的经病理证实的胰腺癌患者42例，其中男32例，女10例，年龄36～86岁，中位年龄62岁。所有患者术前均未行化疗和放疗。同时取我科实验室保存的10例正常胰腺组织作为对照，标本来自意外死亡者，均得到家属同意，并签署书面知情同意书。

二、方法

1．实时定量PCR：应用Trizol(Sigma公司)抽提总RNA，然后用TaKaRa公司的PrimeScript TMRT Reagent Kit逆转录合成cDNA。DNMT3B上游引物5′-TTGAATATGAAGCCCCCAAG-3′，下游引物5′-TGATATTCCCCTCGTGCTTC-3′，产物201 bp;内参18S上游引物5′-CTCTTAGCTGAGTGTCCCGC-3′，下游引物5′-CTGATCGTCTTCGAACCTCC-3′,产物294 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。扩增曲线程序：95℃ 10 s;95℃ 5 s、60℃ 34 s，40个循环。 溶解曲线反应程序：95℃ 15 s,60℃ 60 s, 95℃15 s。胰腺癌或相应癌旁组织△Ct值与10例正常胰腺的△Ct均值相比得到△△Ct，通过计算得到RQ值，RQ=-△△Ct。

2．免疫组织化学染色法：采用常规链霉素抗生物素-过氧化酶方法。用PBS替代一抗作为阴性对照，胃癌标本为阳性对照。胞核呈棕黄色染色判定为阳性。在高倍镜下随机选取5个视野，每视野计数500个细胞，根据阳性细胞率和阳性细胞着色强度分别计分。阳性细胞率≤25%为0分，26% ～ 50%为1分，51% ～ 75%为2分，≥76%为3分。基本未着色或染色强度与背景相似者为0分，着色浅略高于背景色为1分，中等着色明显高于背景而呈棕黄色为2分，强染呈深棕黄色者为3分。根据两项积分之和将DNMT3B表达分为4级：0分和1分为阴性(-)，2分为弱阳性(+)，3分和4分为中等强度阳性(++)，5分及以上者为强阳性(+++)。

三、统计学处理

结 果

一、胰腺癌组织中DNMT3B mRNA和蛋白表达

扩增曲线和溶解曲线显示DNA的扩增产物比较单一，在实验浓度范围内(图1)。

胰腺癌DNMT3B mRNA的RQ值为9.4±5.9，显著高于癌旁组织的1.02±0.71和正常组织的0(P值均lt;0.05)。DNMT3B蛋白阳性染色主要位于肿瘤细胞胞核。胰腺癌组织的阳性表达率为83.3%(35/42)，其中+9例，++17例，+++9例；相应癌旁组织的阳性率为14.3%(6/42)，其中+4例，++2例；正常胰腺组织的阳性率为10.0%(1/10),强度为+(图2)。胰腺癌DNMT3B蛋白表达阳性率显著高于正常胰腺组织和癌旁组织(P值均lt;0.01)。

图1 内参照18S(A)和DNMT3B(B)的实时RT-PCR扩增曲线(1)与溶解曲线(2)

图2 DNMT3B蛋白在正常胰腺组织(A)、癌旁组织(B)和胰腺癌组织(C、D)中的表达(SP ×400)

二、胰腺癌组织DNMT3B mRNA和蛋白表达与临床病理参数的关系

DNMT3B mRNA 表达与临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移密切相关(Plt;0.05或Plt;0.01)；DNMT3B蛋白表达与肿瘤的部位、淋巴结转移有关(Plt;0.01或Plt;0.05)。它们与年龄、性别、神经浸润、肿瘤大小、血CEA和CA19-9浓度均无关(表1)。

表1胰腺癌组织DNMT3B mRNA和蛋白表达与临床病理参数的关系

临床病理参数例数DNMT3BmRNA表达(x±s)DNMT3B蛋白表达率(%)年龄(岁) lt;601910．5±6．778．9 ≥60238．5±5．287．0性别 男329．0±5．384．4 女1010．6±7．880．0肿瘤部位 胰体尾1010．6±6．8100．0b 胰头329．0±5．778．1肿瘤直径(cm) lt;32710．1±6．587．8 ≥3158．1±4．793．3TNM分期 Ⅰ63．8±2．3a66．7 Ⅱ3310．0±5．884．8 Ⅲ313．6±6．4100．0分化程度 低分化913．8±5．0a88．9 中高分化338．2±5．781．8淋巴结转移 有2512．8±5．1b96．0a 无174．3±2．364．7神经浸润 有319．6±6．087．1 无118．9±5．972．7CEA(ng/ml) lt;10349．4±5．788．2 ≥1089．7±7．162．5CA19⁃9(ng/ml) lt;37712．3±4．6100．0 ≥37358．8±6．180．0

注：aPlt;0.05；bPlt;0.01

讨 论

通常情况下，DNA 甲基化和染色质的紧缩状态与基因处于抑制和静息状态相关；而DNA 的去甲基化和染色质的松解状态与基因活化和行使功能有关。DNA 高甲基化的变化会引起基因表达异常，导致细胞恶变，最终形成肿瘤[2]。

文献报道[3-6]，DNMT3B高表达在肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等肿瘤的发生、发展中起非常重要的作用。Park等[3]研究表明，肝癌组织DNMT3B mRNA高表达，且与患者生存期短和预后较差明显相关。Girault等[7]报道，乳腺癌组织DNMT3B mRNA高表达与肿瘤高分化相关，预后较差。本实验结果显示，胰腺癌DNMT3B mRNA和蛋白表达均明显高于癌旁和正常胰腺组织，且与肿瘤部位、临床分期、分化程度和淋巴结转移相关，提示DNMT3B基因可能参与了胰腺癌的发生、发展和转移过程。但胰腺癌组织DNMT3B mRNA和蛋白两者的高表达与临床病理参数的关系并不完全一致，其原因可能与样本量相对较少及DNMT的多种亚型在生物体内有协同作用有关。Ding等[4]也报道过胃癌DNA甲基化转移酶mRNA和蛋白的表达与临床病理参数的相关性并不一致。

[1] Benbrahim-Tallaa L,Waterland RA,Dill AL,et al.Tumor suppressor gene inactivation during cadmium-induced malignant transformation of human prostate cells correlates with over-expression of de novo DNA methyltransferase.Environ Health Perspect,2007,115:1454-1459.

[2] Das PM,Singal R.DNA methylation and cancer.J Clin Oncol,2004,22:4632-4642.

[3] Park HJ,Yu E,Shim YH.DNA methyltransferase expression and DNA hypermethylation in human hepatocellular carcinoma.Cancer Lett,2006,233:271-278.

[4] Ding WJ,Fang JY,Chen XY,et al.The expression and clinical significance of DNA methyltransferase proteins in human gastric cancer.Dig Dis Sci,2008,53:2083-2089.

[5] Lin RK,Hsu HS,Chang JW,et al.Alteration of DNA methyltransferases contributes to 5′CpG methylation and poor prognosis in lung cancer.Lung Cancer,2007,55:205-213.

[6] Oh BK,Kim H,Park HJ,et al.DNA methyltransferase expression and DNA methylation in human hepatocellular carcinoma and their clinicopathological correlation.Int J Mol Med,2007,20:65-73.

[7] Girault I,Tozlu S,Lidereau R, et al.Expression analysis of DNA methyltransferases 1,3A,and 3B in sporadic breast carcinomas.Clin Cancer Res,2003,9:4415-4422.

2009-04-24)

(本文编辑：吕芳萍)

ExpressionofDNA-methy1transferases3Bgeneinpancreaticadenocarcinoma

WANGLi-hua,LIZhao-shen,LIShu-de,DUYi-qi,GAOJun,GONGYan-fang,MANXiao-hua,HUXian-gui.

DepartmentofGastroenterology，ChanghaiHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433，China

LIShu-de，Email：lishude57@126.com;LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the expression of DNA-methy1transferases 3B (DNMT3B) gene in human pancreatic carcinoma and to evaluate its relationship with clinicopathologic parameters.Methods42 samples of pancreatic carcinoma tissues and 42 para-carcinoma tissues and 10 normal pancreatic tissues were collected and the expression of DNMT3B mRNA and protein was detected by real-time PCR and immunohistochemistry techniques.ResultsThe expression of DNMT3B mRNA (RQ level) in human pancreatic carcinoma tissues and para-carcinoma tissues, normal pancreatic tissues was 9.4±5.9, 1.02±0.71 and 0, respectively, and the difference was statistically significant (Plt;0.05). The rate of expression of DNMT3B protein in human pancreatic carcinoma tissues, para-carcinoma tissues and normal pancreatic tissues were 83.3%, 14.3% and 10%, respectively, and the difference was also statistically significant (Plt;0.01). The expression of DNMT3B mRNA correlated significantly with clinical staging, differentiation degree of the tumor and lymph node metastasis (Plt;0.01 orPlt;0.05). The expression of DNMT3B protein correlated significantly with the location of the tumor and lymph node metastasis (Plt;0.01 orPlt;0.05). The expression of DNMT3B mRNA and protein was not associated with age, sex, neural invasion, tumor size, serum CEA and CA19-9.ConclusionsHighly expressed DNMT3B mRNA and protein may indicate the lymph node metastasis and poor prognosis in human pancreatic carcinoma.

Pancreatic neoplasm; Methyltransferases; Gene; Real quantitative RT-PCR; Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.004

国家科技支撑计划资助(2006BAI2A12)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科(王丽华、李兆申、李淑德、杜奕奇、高军、龚燕芳、满晓华)，普三科(胡先贵)

共同通信作者：李淑德，Email: lishude57@126.com;李兆申，Email:zhsli@81890.net