诸琦 李百文 倪培华 曹海峡 黄佳 张愫

·论著·

三元复合因子Net对人胰腺癌细胞株BxPC3增殖的影响

诸琦 李百文 倪培华 曹海峡 黄佳 张愫

目的研究三元复合因子Net转染人胰腺癌细胞株BxPC后的表达状态及对原癌基因c-fos表达的影响。方法采用脂质体2000将重组人pEGFP-Net质粒和空质粒pEGFP转染人胰腺癌BxPC3细胞株，建立稳定高表达Net的细胞系。应用MTT、流式细胞仪等方法检测胰腺癌细胞的增殖，应用实时定量PCR和Western blotting检测Net及c-fos mRNA和蛋白的表达。结果BxPC3细胞低表达Net，转染pEGFP-Net后稳定高表达Net，并抑制c-fos的表达。转染pEGFP-Net的细胞生长缓慢，转染后第3、5、7天的抑制率分别为38.8%、55.3%、56.9%，显著高于空质粒转染组的5.1%、12.4%、8.6%(Plt;0.05)；G0/G1期细胞占(61.8±5.7)%，显著高于空质粒转染组的(45.1±3.4)%。结论三元复合因子Net 能抑制人胰腺癌BxPC3细胞的增殖，其机制可能与抑制c-fos表达有关。

胰腺肿瘤； 三元配合物因子类； Net； c-fos； 细胞增殖

亚族中的一个成员，其特点是能够与血清反应因子(serum response factor, SRF)相互作用，共同结合于原癌基因c-fos启动子上的血清反应元件(serum response element, SRE)，三者共同形成复合体，从而调节c-fos基因的转录和表达[1]。现已明确,Net在正常状态下能明显抑制c-fos的转录[2]。从Net发现至今，结合胰腺癌的基础或临床应用研究却很少。本研究旨在对Net在胰腺癌细胞中的表达及对细胞增殖的影响做初步探讨。

材料与方法

一、质粒构建

根据GeneBank的人Net mRNA 序列设计引物，并在上下游引物的5′端分别加上XhoⅠ和 KpnⅠ的限制性内切酶位点。正义5′-GATCTCGAGATGGAGAGTGCAATCACGCT-3′；反义5′-GAGGGTACC-GGATTTCTGAGAGTTTGAAGA-3′。应用PCR技术扩增Net基因全长cDNA，并将其插入pEGFP-N1载体，构建pEGFP-N1/Net质粒，经酶切及测序鉴定。

二、细胞转染及稳定细胞株的建立

人胰腺癌细胞株BxPC3购自上海中科院细胞所，常规培养传代。转染前24 h将BxPC3细胞以3×105/孔铺入6孔培养板。应用脂质体2000将pEGFP-N1/Net及pEGFP转染BxPC3细胞，应用G418筛选单个细胞克隆，在含200 μg/ml的G418培养液中维持生长和传代。

三、实时定量PCR(real-time PCR)

应用Trizol裂解抽提细胞总RNA，逆转录至cDNA，实时PCR仪上行实时定量PCR(美国MJReseach公司)。Net引物，正义5′-ACGCTGCCAGTA-TTTCATCC-3′，反义5′-GACTAAGGCTGCTCCAGA-AAT-3′，片段387 bp；c-fos引物，正义5′-TGTCAACGCGCAGGACTTCT-3′，反义5′-CCTTCTCCTTCAGCAGGTTG-3′，片段443 bp；内参β-actin引物，正义5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，反义5′- CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGA-GGG-3′，片段658 bp。每组3个复孔。在PCR任意循环中，当荧光强度值大于由仪器自带软件计算出的阈值(CT)时，样本被认为是阳性，mRNA的表达量用2-△CT来表示(△CT=Net/c-fos CT值-β-actin CT值)，实验重复3次，取均值。

四、蛋白印迹

细胞收集后加入裂解液(RIPA，上海申能博彩公司)提取蛋白，取30 g蛋白常规行Western blotting，最后ECL(Amersham Biosciences公司)显影。

五、细胞生长检测

将1×105/孔的亲本细胞及2株转染细胞铺入6孔细胞培养板，设3个复孔。于培养后第 1、3、5、7 天收集细胞，并计数绘制生长曲线。

同时取上述3组对数生长期细胞，以每孔2×103个接种于96 孔板，设3个复孔。培养后第1、3、5、7天每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，继续培养4 h，弃上清，加入100 μl DMSO振荡10 min，测定各孔A492值，取均值。生长增殖抑制率=(1-实验组A492值/对照组A492值)×100%。

六、细胞周期检测

收集各组对数生长期细胞，PBS洗涤后加预冷的70%乙醇4℃固定过夜。弃乙醇后PBS重悬细胞，加1 ml碘化丙啶(PI)染液，避光4℃孵育20 min，流式细胞仪检测细胞周期。

七、统计学处理

结 果

一、细胞Net 和 c-fos mRNA及蛋白表达的变化

pEGFP-N1/Net转染组、空质粒转染组、亲本BxPC3组的Net mRNA表达量分别为34.73±0.46、9.45±0.23、9.43±0.30，pEGFP-N1/Net转染组明显高于其他两组(Plt;0.01)；3组c-fos mRNA表达量分别为10.39±0.60、31.60±1.20、33.22±0.95，pEGFP-N1/Net转染组明显低于其他两组(Plt;0.01)。各组细胞Net和c-fos蛋白表达的变化趋势与mRNA表达趋势相一致 (图1)。

图1 Net及c-fos蛋白在各组中的表达变化

二、各组细胞生长和增殖的改变

pEGFP-N1/Net转染组细胞生长明显慢于空质粒转染组和亲本BxPC3组(图2，Plt;0.05)，而空质粒转染组和亲本BxPC3组间无明显差异。

pEGFP-N1/Net转染组细胞培养后第1、3、5、7天的增殖抑制率分别为1.0%、38.8%、55.3%、56.9%；空载体转染组为0.8%、5.1%、12.4%、8.6%，从第3天起差异显著(图3，Plt;0.01)。

三、各组细胞的周期变化

pEGFP-N1/Net组G0/G1期细胞占(61.8±5.7)%，S期细胞占(27.4±4.9)%；亲本BxPC3组分别为(46.9±4.3)%和(47.3±7.2)%；空质粒转染组分别为(45.1±3.4)%和(46.8±5.6)%。Net转染后使细胞周期明显阻滞在G0/G1期(Plt;0.01)。其他两组间无明显差异。

图2 Net过表达对胰腺癌细胞生长曲线的影响

图3 Net过表达对胰腺癌细胞增殖的影响

讨 论

原癌基因转录的调控可能在癌基因启动过程中起到了“开关”的作用，因此研究癌基因转录调节可能为寻找治疗肿瘤的新靶点提供希望。转录调节因子TCFs家族有3个成员：Net、ELK-1和Sap-1[3-4]。虽然它们具有相似的结构域，但在转录调节上的作用不同。生理状态下，Net对靶基因c-fos的转录起明显抑制作用，但当外界刺激通过Ras-丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路后，使Net失去有效的抑制功能，原癌基因c-fos则迅速启动转录，促进细胞无限制增殖。

c-fos是与胰腺癌高度相关的一个原癌基因。Sakorafas等[5]报道，胰腺癌c-fos基因过度表达；Lee等[6]研究发现，c-fos过度表达与胰腺癌的进展密切相关。本实验结果也显示BxPC3细胞的c-fos mRNA 和蛋白均呈明显高表达。业已证实，c-fos的短时诱导转录主要受SIE、SRE、CRE以及FAP-1等4个启动元件调节[7]。但大多数的信号是通过调控SRE启动c-fos转录[8]。TCF、SRF的磷酸化可激活SRE，但持续激活SRE更主要的原因可能是SRE抑制因子的缺失[9]。Net作为抑制因子，它的缺失或改变可能是SRE持续激活的主要原因。本实验结果显示，BxPC3细胞低表达Net，而高表达c-fos。当我们把外源性Net表达质粒转染到该细胞后，Net高表达，而c-fos的表达明显减少，提示Net过表达确实存在对c-fos表达的抑制。同时，细胞的生长和增殖明显被抑制，细胞周期大部分停滞于 G0/G1期，表明外源性转染导致的Net过表达阻滞胰腺癌的细胞周期进程及细胞增殖可能与其抑制原癌基因c-fos的转录有关。

[1] Buchwalter G,Gross C,Wasylyk B,et al.Ets ternary complex transcrip- tion factors.Gene,2004,324:1-14.

[2] Hollenhorst PC, Jones DA, Graves BJ. Expression profiles frame the promoter specificity dilemma of the ETS family of transcription factors. Nucleic Acids Res, 2004, 32: 5693 - 5702.

[3] Iwata A, Miura S, Kanazawa I, et al. Alpha-Synuclein forms a complex with transcription factor Elk-1. J Neurochem, 2001, 77: 239-252.

[4] Stinson J, Inoue T, Yates P, et al. Regulation of TCF ETS-domain transcription factors by helix-loop- helix motifs. Nucleic Acids Res, 2003, 31: 4717-4728.

[5] Sakorafas GH, Tsiotou AG, Tsiotos GG. et al. Molecular biology of pancreatic cancer; oncogenes, tumour suppressor genes, growth factors, and their receptors from a clinical perspective. Cancer Treat Rev, 2000, 26: 29-52.

[6] Lee CS, Charalambous D. Immunohistochemical localization of the c-fos oncoprotein in pancreatic cancers. Zentral Pathol, 1994, 140: 271-275.

[7] Gonzales M, Bowden GT. Ultraviolet B (UVB) induction of the c-fos promoter is mediated by phospho-cAMP response element binding protein (CREB) binding to CRE and c-fos activator protein 1 site (FAP1) cis elements. Gene, 2002, 293: 169-179.

[8] Brellier F, Marionnet C, Chevallier-Lagente O, et al. Ultraviolet irradiation represses PATCHED gene transcription in human epidermal keratinocytes through an activator protein-1- Dependent Process. Cancer Res, 2004, 64: 2699-2704.

[9] Van Riggelen J, Buchwalter G, Soto U, et al. Loss of net as repressor leads to constitutive increased c-fos transcription in cervical cancer cells. J Biol Chem, 2005, 280: 3286-3294.

2009-02-23)

(本文编辑：吕芳萍)

TheeffectofternarycomplexfactorNetontheproliferationofhumanpancreaticcarcinomacelllineBxPC3

ZHUQi,LIBai-wen,NIPei-hua,CAOHai-xia,HUANGJia,ZHANGSu.

DepartmentofGastroenterology,RuijinHospital,MedicalSchool,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China

ZHUQi,Email:zhuqi@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of the ternary complex factor Net in human pancreatic carcinoma cell line BxPC3 and its effect on cell proliferation and the expression of c-fos.MethodspEGFP-Net prokaryotic expression plasmid and empty vector pEGFP were transfed into BxPC3 cells by using lipofectamine 2000, then monoclonal cell which stably expressing Net was established. Human pancreatic carcinoma cells proliferation was detected by MTT and flow cytometry. The mRNA and protein expression of Net and c-fos in BxPC3 cells were detected by real-time PCR and Western blot.ResultsNet was low expressed in BxPC3 cells. After pEGFP-Net transfection, Net was stably expressed and the expression of c-fos was inhibited, cell proliferation was also inhibited after pEGFP-Net transfection, the inhibitory rates at the 3rd, 5th, 7th day was 38.81%, 55.34% and 56.92% respectively，which were significantly higher than those in the empty vector group (5.09%, 12.42%, 8.6%,Plt;0.05). G0/G1phase cell was (61.79±5.67)%, which were significantly higher than (45.14±3.37)% in the empty vector group (Plt;0.05).ConclusionsThe ternary complex factor Net could inhibit pancreatic carcinoma cell line BxPC3 proliferation. Its mechanism was possibly repressing expression of oncogene c-fos.

Pancreatic neoplasms; Ternary complex factors； Net； c-fos； Cell proliferation

Net基因是E-twenty-six(Ets)结构域转录因子家族三元复合因子(ternary complex factors, TCFs)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.008

上海市教委科研资助项目(05BZ40)

200025 上海，上海交通大学医学院附属瑞金医院消化科(诸琦、李百文、曹海侠、黄佳、张愫)，检验系(倪培华)

诸琦，Email:zhuqi@medmail.com.cn