程晓霞　朱小丽　王　劭　陈仕龙　林锋强　李兆龙　陈少莺

摘要 从临床表现呼吸困难并伴有啰音、肺部和支气管黄色干酪样栓塞为特征的病鸡肝脾肺混合匀浆中分离到1株病毒(YD株),该病毒能凝集鸡红细胞并能被AIV H9标准阳性血清抑制,对热不稳定且对热敏感;对鸡胚和番鸭胚的最小致死量分别为10-7和10-6,其MDT分别为78h和70h;鸡胚尿囊液毒的HA效价和EID50明显高于番鸭胚尿囊液毒;能扩增出大小约为1 027bp的特异性目的片段。结果表明,该分离毒为H9亚型禽流感病毒。

关键词 H9亚型禽流感病毒;分离;鉴定

中图分类号 S858.31 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2009)13-0303-03

禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)属正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒。禽流感又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟,被国际兽医局(OIE)列为A类传染病。AIV H9亚型为低致病性禽流感病毒,主要引起禽类产蛋量下降,肉鸡和蛋鸡的复合型呼吸道疾病乃至死亡,可使养禽业产生重大损失。

2007年11月,福建省某鸡场发现80～90日龄的大鸡出现精神萎顿、羽毛松乱、食欲减退、呼吸困难并伴有啰音为特征的病例,并很快地传染给小鸡,2 000羽鸡1周内连续死亡200羽。死亡鸡病理剖检可见肺部和支气管里有许多黄色干酪样栓塞,部分死亡鸡支气管剖开有白色分泌物。通过病毒分离、电镜观察、血清学和RT-PCR鉴定确定为H9亚型禽流感病毒,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验胚及动物

番鸭胚、鸡胚、30日龄无母源抗体雏鸡等均来自非疫区。

1.2 标准阳性血清及单克隆抗体

抗新城疫病毒(NDV)阳性血清购于中国兽药监察所;抗减蛋综合征(EDSV76)阳性血清和抗H5、H7、H9亚型禽流感病毒阳性血清均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。抗新城疫病毒(NDV)单抗和抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)单抗均由实验室保存。

1.3 试验试剂

TriZol LS Reagent,RNasin,M-MLV购自Invitrogen公司,rTaq聚合酶、dNTPs、pMD18-T、感受态细胞DH5α购自大连宝生物工程公司。

1.4 病毒分离

1.4.1 病料采集及处理。无菌采集死亡鸡的心、肝、脾、肺、肾,剪碎研磨,以Hanks液制成1∶5匀浆,加双抗各1 000U,4℃过夜,冻融3次,7 000rpm离心10min,取上清液供接种病料。

1.4.2 病毒分离。取处理的病料上清液经尿囊腔接种9日龄鸡胚3枚,0.1mL/枚,37℃孵化,观察2次/d,弃去24h内的死胚,收取24～120h的死胚或活胚,置4℃过夜后,收获鸡胚尿囊液,并观察胚胎病变。

1.5 血清学鉴定

1.5.1 间接免疫荧光抗体(IFA)试验。取死胚的心脏冷冻切片,冷丙酮固定后,按常规方法[1]用抗NDV和IBDV单抗进行间接荧光抗体试验。

1.5.2 血凝价(HA)测定。参照Allan等[2]的报道,测定鸡胚尿囊液的HA价。

1.5.3 血凝抑制试验(HI)。用4个血凝单位的分离毒(第3代胚液毒)分别与抗新城疫、抗EDSV76 和AIV H5、H7、H9等标准阳性血清,按微量法进行HI试验[3]。

1.6 分离毒生物学特性

1.6.1 血球凝集(HA)试验。采集小白鼠、鸽、鸭和鸡的红细胞,按常规方法进行HA试验。

1.6.2 血凝素热稳定性试验。将第3代胚液毒(YD3)分装于灭菌离心管,于56℃水浴分别作用0min、5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min,测定各自的HA效价。

1.6.3 耐热性试验。将第3代胚液毒分装于灭菌离心管,于50℃水浴分别作用10min、20min、30min、60min,60℃水浴分别作用10min、20min、30min后,分别接5枚非免疫鸡胚,37℃培养,收集鸡胚尿囊液测定HA效价。

1.6.4 对鸡胚、番鸭胚的ELD50和最小致死量平均死亡时间(MDT)的测定。将分离毒用Hanks液作连续10倍倍比稀释,每个稀释度接种4枚9日龄鸡胚或12日龄番鸭胚,0.1 mL/枚,37℃孵化,弃去24h内的死胚,以后每2h照蛋1次,记录胚胎死亡情况,按Karber氏法计算ELD50。根据文献计算全部胚胎死亡的最高稀释度MDT[4]。

1.7 RT-PCR鉴定

1.7.1 病毒RNA的提取。取感染AIV H9N2鸡胚尿囊液250 μL,加入750μL TriZol LS Reagent RNA提取液,混匀,室温放置15min,加入200μL氯仿,振荡混匀,4℃ 12 000rpm离心15min,取上清加入500μL异丙醇,室温放置10min后12 000rpm离心10min,弃上清,75%乙醇除盐,倒置滤纸上吸掉剩余液体,干燥后悬于25μL的DEPC水中,备用。

1.7.2 引物设计。根据禽流感M基因全长序列,用Oligo 6软件设计1对引物如下:上游引物P1为5′-AGCAAAAGCA GGTAGATG-3′,下游引物P2为5′-AGTAGAAACAAGGTA GTTTTTTAC-3′,以上引物由大连宝生物TAKARA公司合成。

1.7.3 RT-PCR反转录聚合酶链式反应。①RT采用20μL体系,在PCR反应管中分别加入7μL已制备的RNA,加入1μL下游引物(20pmoL),70℃热吸附10min,冰浴10min,继续加入5×First Standing Buffer 4μL,10mM dNTPs 2μL,0.5μL反转录酶(M-MLV)5U/μL,0.25μL RNA酶抑制剂(40U),用无RNA酶水调至总体积20μL,瞬时离心混匀。反应程序:30℃ 10min,42℃ 60min,99℃ 5min。②M基因的扩增用50μL体系。以制备好的cDNA 2μL作模版,加入相应的上、下游引物(20pmoL)各1μL,2.5mM dNTPs 4μL,10×Buffer 5 μL,rTaq 1μL,灭菌水36μL,反应体系50μL。在PCR扩增仪内进行扩增,扩增条件为95℃预变性 5min,然后94℃ 变性1min、53℃ 变性1min、72℃延伸2min,35个循环,最后72℃延伸10min。结束后取PCR产物4μL,在1%琼脂凝胶上电泳检查,然后在紫外灯下观察结果,自动凝胶成像扫描仪拍照及处理。

1.8 人工感染试验

将分离毒鸡胚尿囊液毒原液经腿肌注射30日龄雏鸡3羽,每羽0.5mL;另取3羽,注射生理盐水,每羽0.5mL,隔离饲养。观察发病情况和临床症状,并从病死鸡中进行病毒分离或测定耐过鸡血清抗体。

2 结果与分析

2.1 病毒分离

鸡胚接种病料96h后开始死亡,死胚的胚体呈弥漫性充血、出血,其HA效价为27。连续盲传3代,病毒增殖趋于稳定,接种分离毒36h开始死亡,其HA效价为29。分离毒按Karber氏法计算对鸡胚的ELD50为10-5.5。

2.2 血清学鉴定

2.2.1 IFA试验。死胚心脏冷冻切片,经抗NDV和IBDV单抗染色后,均未发现有荧光病灶。

2.2.2 血凝抑制试验(HI)。分离毒的血凝特性能被AIV H9标准阳性血清所抑制,但不被新城疫、减蛋综合征和AIV H5、H7标准阳性血清所抑制。

2.3 分离毒生物学特性

2.3.1 血球凝集(HA)试验。分离毒YD3对小白鼠、鸽、鸭和鸡的红细胞均有凝集作用。其HA效价为小白鼠27、鸽29、鸭27、鸡28。

2.3.2 血凝素热稳定性试验和耐热性试验。该分离株在56℃水浴处理10min,其HA效价下降2个滴度;在60℃处理30min后,具有HA效价的鸡胚数下降2枚。表明该分离株对热不稳定性。

2.3.3 ELD50和MDT的测定。鸡胚尿囊液毒的HA效价和鸡胚半数感染量明显高于番鸭胚尿囊液毒;分离毒对鸡胚和番鸭胚的MDT分别为78h和70h,其最小致死量分别为10-7和10-6。

2.4 RT-PCR鉴定

从分离毒的鸡胚尿囊液中扩增出1 027bp片段。

2.5 人工感染试验

3羽30日龄雏鸡经腿肌注射分离毒后,在20d观察期内均未发现异常。血清HI抗体测定结果表明,攻毒前HI为阴性,攻毒10d后抗H9亚型HI均在28以上。

3 结论与讨论

从肺部有黄色干酪样栓塞和支气管有白色分泌物的病死鸡肝、脾、肺、肾中分离到1株病毒,经鉴定为H9亚型禽流感病毒,命名为AIV-YD株。该分离毒AIV-YD具有血凝活性,并能被AIV H9标准阳性血清抑制,但不被新城疫、减蛋综合征和AIV H5、H7标准阳性血清所抑制。生物学试验表明:该分离毒具热不稳定性且对热敏感;分离毒在鸡胚尿囊液的HA效价和鸡胚半数感染量明显高于番鸭胚尿囊液;鸡胚和番鸭胚的MDT分别为78h和70h;而且分离毒YD3对鸡胚和番鸭胚的最小致死量分别为10-7和10-6;PCR结果表明,所扩增出的片段大小约为1 027bp,与预期长度相符。这些结果表明分离毒为H9亚型禽流感病毒。

陈伯伦等[5]于1994年首次从鸡中分离到了AIV H9 亚型。Alexander[6]认为目前H9亚型流感病毒广泛存在于家禽中,对养禽业构成严重威胁,而1997年香港“禽流感”事件之后Peiris等[7]从类似流感症状的病人中分离到H9N2亚型流感病毒。近年来AIV H9 亚型对全世界的威胁已经越来越严重,应引起广大学者的重视。

4 参考文献

[1] 程由铨,林天龙,胡奇林,等.雏番鸭细小病毒病分离与鉴定[J].病毒学报,1993,9(3):228-235.

[2] LANG G,FERGUSON A E,CONNELL M C,et al.Isolation of an unidentified hernagglutination from the respiratory tract of turkeys[J].Avian Dis,1964(8):495-504.

[3] ALLAN W H,GAUG R E. A standard hemagglutination inhibitton test for Newcastle disease:(1)A comparison of micro and micro methods[J].Vet Rec,1974(95):120-123.

[4] ALEXANDER D J. Newcastle Disease In:A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens[M].Iowa:Kendall/Hunt Pubilshing Company,1989.

[5] 陈伯伦,张泽纪,陈伟斌.鸡A型流感病毒的分离与血清学初步鉴定[J].中国兽医杂志,1994,20(10):3-5.

[6] TAISUKE H,YOSHIHIRO K. Andemic threat pose by avain influenza A virus[J].Clinical Microbiology Reviews,2001(14):126-149.

[7] JOHNSON N P,MUELLER J. Updating the accounts:global mortality of the 1918-1920“Spanish”influenza Pandemic[J].Bull Hist Med,2002(76):105-115.