黄华扬 王泽锦 李凭跃 郑小飞 王庆 沈洪园

基础研究

异种半月板移植实验研究的初步报告

黄华扬 王泽锦 李凭跃 郑小飞 王庆 沈洪园

目的观察生物型异种半月板移植修复羊半月板缺失的效果，探讨生物型半月板重建正常膝关节半月板的可行性。方法以猪膝关节内侧半月板为供体，应用环氧固定技术对猪半月板进行去抗原处理，制成生物型异种半月板移植体。随机切除6只山羊一侧膝关节内侧半月板，将生物型异种半月板塑形并与羊内侧半月板的形态和尺寸相匹配，原位植入半月板缺失部位。分别于术后12周、24周、36周处死动物，对移植半月板、股骨内侧髁及内侧胫骨平台进行大体形态、病理切片和电镜扫描观察。结果随着时间延长，异种移植半月板与周边组织愈合良好，并逐渐被新生组织替代；术后12周，移植膝关节软骨未见退变，24～36周后移植膝关节软骨出现轻度退变，移植半月板出现被吸收和宿主纤维母细胞爬行替代现象。结论我们初步认定，生物型异种半月板作为羊半月板缺失移植的供体可被宿主细胞逐渐替代，逐步形成新生的自体半月板，且短期内对移植膝关节软骨具有明显的保护作用；在实验各阶段均未出现明确的免疫排斥反应。

半月板，胫骨；移植，异种；软骨，关节；山羊

膝关节半月板损伤是最常见的运动性损伤之一。随着对半月板的深入认识，其在完成膝关节复杂生物力学功能中的重要作用已毋庸置疑。对于毁损性半月板损伤，目前多采用同种异体半月板移植进行修复，疗效确切，预后良好[1-3]，但在临床应用中具有传播疾病的风险，存在受体选择、伦理学等问题。异种半月板取材容易，来源广泛，塑形方便且易保存，可以有效地解决同种异体半月板移植供体来源不足、难以匹配等问题，但相关报道十分有限[4-7]。本研究旨在通过观察生物型异种半月板（以猪半月板为供体）修复羊半月板损伤的效果，以期为异种半月板移植方法的可行性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～12月龄山羊共6只，雌雄不限，体重15～30 kg，由解放军一五七医院动物实验中心提供。

1.2 猪半月板移植体的制备

取猪半月板，以环氧化物作为交联剂，加上多重蛋白修饰技术，制备成去抗原生物型异种半月板，并进行灭菌照射处理。

1.3 异种半月板移植手术

随机选取山羊一侧膝关节，暴露并切断内侧副韧带在股骨的止点，将内侧半月板从关节囊附着处切除，保留羊半月板前、后角韧带及半月板胫骨韧带，修剪生物型半月板至合适大小（图1），用丝线将移植半月板前、后角韧带与羊半月板韧带缝合，然后采用U形缛式缝合将半月板体部与半月板胫骨韧带相固。术后关节不制动，放养。常规使用氯霉素、青霉素预防感染。将6只动物随机分成3组，每组2只，分别于术后12周、24周、36周用氯化钾静脉注射处死动物，分别取植入膝和对侧膝的半月板和关节软骨备用。

1.4 观察和检测指标

术后观察山羊步态、手术肢体活动及伤口愈合情况。取材后，观察移植半月板与周围组织的愈合情况及其在膝关节内的大体改变，观察半月板的色泽、有无破损及被吸收情况以及股骨内侧髁和内侧胫骨平台关节软骨的变化。半月板植入12周、24周、36周后，将植入半月板和关节软骨分别取材，标本经固定、脱钙处理后按常规石蜡包埋，5 μm连续切片，苏木精—伊红染色，光学显微镜下观察组织结构。取部分移植膝半月板、股骨内侧髁及内侧胫骨平台软骨，0.2 mol/L 3%戊二醛固定2 h，经PBS缓冲液清洗、饿酸固定、系列脱水、乙酸异戊酯置换、临界点干燥后，样品表面镀金，冷场扫描电镜(JSM6330F-JEOL)观察生物型半月板及关节内软骨的形态和结构。所有观察均将同一山羊对侧膝内侧半月板及软骨作为对照。

2 结果

2.1 大体观察

2.1.1 动物一般情况 移植术后6只动物患肢切口均愈合良好，无感染，无死亡。动物手术后1周内活动明显减少，轻度跛行；1周后活动逐渐好转，动物患肢站立时可触地，跛行逐渐减轻，3周后基本恢复正常，未见明显的患膝活动受限。

2.1.2 移植半月板及移植膝关节软骨情况 术后12周，植入半月板位置良好，形态正常，颜色无改变，关节内有轻度滑膜增生，半月板前后角韧带结合部均愈合良好,体部为不完全愈合，但体部与胫骨平台及半月板胫骨韧带接触面连接紧密；未见内侧胫骨平台及股骨内侧髁负重面软骨损伤。术后24周，植入半月板位置良好，形态正常，无破损及变形，半月板负重面稍粗糙，颜色未见明显改变，半月板前后角均愈合良好，体部外缘少量组织连接，与胫骨平台、关节囊结合部结合紧密；可见无半月板覆盖的内侧胫骨平台及股骨内侧髁负重面表面软骨稍粗糙。术后36周，植入半月板位置良好，形态正常，颜色略发黄，半月板前角、体部丝线缝合处见半月板组织被吸收后出现凹陷，范围约2 mm×1 mm大小，滑膜增生覆盖凹陷处（图2A），半月板游离缘未见明显吸收，前后角及体部均愈合良好，与关节囊结合紧密；本组半月板的整个内侧胫骨平台及股骨内侧髁负重面表面粗糙，触及有磨砂感（图2B），透明软骨颜色变淡变薄。实验动物均未见溃疡性软骨损伤、软骨深部损伤及关节边缘骨赘形成。

图1 修剪异种半月板至合适大小，保留部分猪半月板前、后角韧带 图2异体半月板移植术后大体观察 2A 术后36周，植入半月板前角、体部丝线缝合处见部分半月板组织被吸收后出现凹陷 2B 术后36周，移植膝股骨内侧髁负重面表面粗糙，失去光泽

2.2 组织学观察

术后12周，植入半月板前角周围自体组织无急性炎症反应；自体新生的纤维结缔组织分布于植入体周围，局部见肉芽组织增生，长入并包绕植入体，有细胞区域范围小、深度浅（图3A）；移植膝股骨内侧髁及内侧胫骨平台未见纤维母细胞明显增生，间质未见炎细胞浸润。术后24周，可见植入半月板组织结构保存，未出现急性排斥反应；自体组织见肉芽组织形成，长入植入体的新生血管较12周时增多，并由半月板结合部至游离缘蔓延，肉芽组织包绕、分割植入体伴纤维化，有细胞区域扩展迅速（图3B）；移植膝股骨内侧髁及内侧胫骨平台透明软骨细胞轻度增生，表面可见增生的纤维母细胞，间质未见炎细胞浸润。术后36周，植入半月板组织结构仍未见明显破坏；肉芽组织间质内淋巴细胞、浆细胞较前增多，新生的毛细血管长入植入体内的范围、深度均较24周增大、加深，并于植入体边缘发现疑似自体纤维软骨细胞，有细胞区域已达到植入体的1/2（图3C，3D）；移植膝股骨内侧髁及内侧胫骨平台透明软骨细胞明显增生，轻度变性（图3E）。各组股骨内侧髁及内侧胫骨平台未见坏死及纤维化，其下骨小梁未见异常。实验各阶段对侧正常膝半月板及关节软骨均未见明显退变。

2.3 扫描电镜观察

正常山羊半月板表面平整光滑，可见大量平行或交叉排列的胶原纤维束，不同部位其胶原纤维排列方式不同。去抗原异种半月板表面呈波浪状，与山羊半月板类同；体部纤维束走行与半月板边缘一致，中间呈交叉走行，前后角呈放射状走行。术后36周，异种半月板内部各方向胶原纤维的排列仍维持，未见紊乱及明显吸收现象，但半月板表面光滑度逐渐改变（图4），且随着时间延长，其改变更加明显。

图3 移植半月板术后组织学观察 3A 术后12周，肉芽组织增生，长入并包绕植入体，有细胞区域范围小深度浅（×40）3B 术后24周，肉芽组织包绕、分割植入体伴纤维化，有细胞区域扩展迅速（×40）3C 术后36周，肉芽组织间质内淋巴细胞、浆细胞较前增多，有细胞区域替代已达到植入体的1/2（×40）3D 术后36周，于植入体边缘发现疑似自体纤维软骨细胞（×400）3E术后36周，移植膝股骨内侧髁透明软骨细胞明显增生，轻度变性（×40）（苏木精—伊红染色）图4移植半月板术后电镜观察 4A术后12周，半月板表面光滑，未见明显毛糙（×1 000）4B 术后24周，半月板表面突起渐增加（×1 000）4C 术后36周，植入半月板内部各方向胶原纤维的排列仍维持，未见紊乱及明显吸收现象（×6 000）4D 术后36周，植入半月板表面光滑度发生改变（×500）

3 讨论

对于半月板损伤的治疗，目前认为应以保留或恢复半月板功能为原则。半月板移植可以最大限度地保留、恢复半月板功能和膝关节稳定性，从而延迟膝关节骨性关节炎的发生[8-9]。膝半月板移植技术通常分为同种异体半月板移植和异种异体半月板移植。同种异体半月板移植后在关节内的转归是一个移植半月板组织坏死并由自身组织长入的过程[10]，作为支架，同种异体半月板更接近于自身半月板基质，且与关节内胫骨平台及股骨髁高度匹配，但同种异体移植存在供体来源有限，大小、形态匹配有一定难度等问题，因而阻碍了其进一步地推广和普及。异种异体移植供体来源充足、取材方便、具有天然的力学特性及生物活性。国外有学者[11-12]尝试采用猪小肠黏膜下层组织进行犬半月板移植修复，结果显示异种组织可促进犬大面积缺损半月板的再生，延缓关节软骨的退变过程，从而有利于半月板功能的恢复。国内余家阔等[4]报道了异种异体和同种异体半月板移植修复兔膝关节半月板缺失的预后研究，结果表明，异种异体半月板移植后短期内半月板的关节软骨情况良好，但24周后移植物部分被吸收，关节软骨出现退变和损伤；之后谢兴等[5]的研究发现，尽管异种异体半月板移植修复兔半月板损伤术后24周移植半月板被破坏，关节软骨出现退变，但与同期的半月板切除膝相比，关节软骨退变较轻，由此推测异种异体半月板移植对关节软骨具有保护作用。

本实验的前期工作[6]对猪半月板进行了解剖形态学研究，结果证实其可以通过组织修整达到异种半月板移植的厚度匹配，从而为大型动物异种半月板移植提供了现实的可能性。本实验以山羊作为实验动物，选用了与人类胶原基因具有高度同源性的猪半月板作为移植材料，将其塑形并与羊半月板相匹配，试图通过移植后的修复效果来探讨大型动物异种半月板移植的可行性。

针对异种异体移植物的抗原性问题，有研究证实，去抗原猪半月板具有良好的生物支架作用，体外生物相容性良好，不易被生物酶降解[13-15]，因此本实验利用已取得专利的去抗原处理技术（以环氧化物作为交联剂，加上多重蛋白修饰去抗原技术）制备了去抗原生物型异种半月板，不但彻底去除了异种蛋白的免疫原性，而且保留了组织的天然机械性能，没有毒性残留物，从而降低了异种异体移植材料的免疫排斥反应。

本实验中异种半月板在各个阶段均能保持位置良好，未出现脱出或偏移，我们在半月板移植手术中采用了保留部分韧带的固定方法，使缝合更加牢固，更利于组织生长和愈合。随着时间的延长，植入的异种半月板与关节囊及周围软组织愈合良好；术后12周、24周后未见明显半月板吸收及破损；术后12周、24周、36周各组组织切片均见肉芽组织长入并逐渐纤维化，宿主细胞逐渐替代供体组织，未见明显排异反应；36周时移植体仍维持原有组织结构。由此可见植入异种半月板可在羊膝关节内存活，并随着植入时间的延长，逐渐被自体组织所替代。实验结果还显示，术后36周于植入体边缘发现疑似自体纤维软骨细胞，细胞胞浆类似软骨陷窝，但其胞浆呈嗜酸性，胞核大，较深染，又与纤维软骨细胞有所不同，我们认为此类细胞的出现可能与自体细胞在长入植入体内、逐渐替代异种组织的同时具有向纤维软骨细胞转化的趋势有关。此外，术后36周时植入半月板体部丝线缝合处可见半月板组织被吸收后出现凹陷，范围较小，组织切片见肉芽组织间质内淋巴细胞、浆细胞较前增多。分析原因可能包括以下两点：（1）塑形后异种半月板移植体尽管在形态、尺寸上与羊半月板相差无几，但由于成年猪半月板较山羊大且厚，塑形时为避免损伤移植体表面光滑度而放弃改变其厚度，因此其在前后角、游离缘及厚度等方面与受体半月板存在一定的差异，使其与受体关节在结构上不能完全匹配；（2）丝线缝合部位刺激引起淋巴细胞、浆细胞聚集，从而导致异种移植体被吸收。幼猪半月板的大小、厚度与成年羊相当，不须塑形即可大大提高关节内匹配度，且不必损伤植入半月板表面光滑度，故我们认为幼猪半月板应为更适用于羊半月板移植的生物材料。

临床研究表明，半月板部分切除或全切除会加速膝关节软骨退变[16，17]。从本实验的观察结果来看，术后12周，组织切片未见透明软骨细胞及纤维母细胞明显增生，骨小梁未见异常，未见明显软骨退变及软骨下骨坏死。尽管此时移植半月板大部分没有活细胞，但对受体膝关节起到了支撑及稳定的作用，使膝关节不会由于过早地丢失关节间隙而导致骨性关节炎的提前发生，由此推测异种半月板在保护受体膝关节软骨、延缓软骨退变中起到重要作用。术后24周，无半月板覆盖的内侧胫骨平台及股骨内侧髁负重面表面软骨稍粗糙，此时的关节软骨退变可能是由于异种半月板游离缘与羊半月板游离缘之间存在差异而使得移植半月板对羊胫骨平台的覆盖面不同所致。术后36周，软骨表面粗糙，轻度变性，半月板出现被吸收现象，说明半月板损伤与软骨退变存在相关性。术后24周、36周，移植膝内侧胫骨平台和股骨内侧髁软骨的退变较对侧膝明显，此时移植的异种半月板体部表面光滑度被破坏，部分组织被吸收，移植体与关节的匹配度受到影响，关节退变开始加速，因此，异种异体移植对于实验动物半月板损伤的近期修复效果如何维持，对关节软骨的保护作用能否持续，其长期影响有待进一步的深入探讨。

综上所述，我们对异种半月板移植的初步实验研究得出以下结论：生物型猪半月板移植体在半月板切除的羊膝关节内可以存活，并逐渐被自体组织所替代，自体细胞有向纤维软骨细胞转化的趋势；异种半月板对移植膝关节软骨具有延缓软骨退变的作用，且未见明显的免疫排斥反应。本实验证实了异种半月板移植的短期效果，为拓宽半月板移植来源提供了实验依据，但仍存在不足之处，如样本量少、未设立同种异体对照组、缺乏去抗原生物型异种半月板的生物力学研究数据、移植的远期效果有待观察等等。这些将在今后的实验中进一步完善。

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（本文编辑 白朝晖）

Xenogenic meniscus transplantation:preliminary report of an experimental study

HUANG Hua-yang,WANG Ze-jin,LI Ping-yue,ZHENG Xiao-fei,WANG Qing,SHEN Hong-yuan.Department of bone and joint diseases,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510010,China

Objective To observe the effects of xenogenic meniscus transplantation for repair of goat meniscal defects.Methods Xenogenic meniscus grafts were harvested from medial meniscus of pigs'knee joint.This was accomplished through the use of epoxy fixation technique and molding of the donor menisci to the same shape and size as the host.These menisci were then transplanted into goat hosts.In total six goats were utilized.After transplantation,goats were sacrificed at 12,24,and 36 weeks to observe the implanted menisci and the articular cartilage on medial femoral condylus and medial tibial plateau with the use of gross inspection,histological study and SEM.Results After xenotransplantation,the grafts were well accepted and tolerated.The graft articular cartilage appeared normal at 12 weeks after transplantation.However,at 24～36 weeks,the articular cartilage showed signs of degeneration with the meniscus appeared to have been absorbed,and host fibroblast infiltration. Conclusions It is preliminarily considered that xenogenic meniscus transplants are gradually replaced by host cells,thus transforming them into menisci which are virtually indistinguishable from the host'own,furthermore, the transplantation can protect joint articular cartilage obviously in short term;definite immunological rejection was not discovered during each period.

Menisci,tibial;Transplantation,heterologous;Cartilage,articular;Goats

R617,R687.4

A

1674-666X(2009)02-0117-05

10.3969/j.issn.1674-666X.2009.02.010

广东省科技计划项目（2007B031000003）

510010广州，广州军区广州总医院骨病关节科

E-mail：jionhzy@sina.com