王改芳

摘要对酵母双杂交系统原理、组成以及酵母双杂交在生命科学中的应用进行了综述，以期为酵母双杂交系统在生命科学中的应用提供理论依据。

关键词酵母双杂交系统；生命科学；应用

中图分类号Q786文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）04-0259-01

1酵母双杂交技术的基本原理

酵母双杂交系统（two-hybrid system）也叫相互作用陷阱（interaction trap），是1989年由Stanley和Song等提出并初步建立的，并于20世纪90年代得到发展。酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4，在结构上是组件式（modular）的，往往由2个或2个以上结构上可以分开、功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（acti-vation domain，DNA-AD）。这2个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的二者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

2酵母双杂交系统的组成

一个酵母双杂交系统包括3个部分：带有1个或多个摄制报告基因的宿主菌株；与GAL4-BD融合表达蛋白，被表达的蛋白称为旅馆诱饵蛋白（bait）；GAL4-AD融合表达载体，被表达的蛋白称为靶蛋白（prey）。为了防止酿酒酵母内源性的GAL4的影响，人们将该基因误敲除掉，发展成双杂交宿主菌株。常用的缺陷型酵母菌株有SFY526和HF7c，带有特定的报告基因lacZ 、his3和leu2等，但丧失表达内源GAL4转录激活因子的能力。所用的质粒载体为能在大肠埃细菌和酿酒酵母中进行复制的穿梭质粒。第1种质粒载体是pGBT9，又叫DNA-BD载体。诱饵蛋白基因是按照正确的取向和读码结构被克隆在这个载体的多克隆位点上，于是就在诱饵蛋白GAL4-BD之间产生融合作用，形成杂种蛋白Ⅰ。第2种质粒载体是pGAD424，又叫AD质粒载体，是用来构建欲筛选靶蛋白的cDNA文库的专用载体。克隆的cDNA片段是按照正确的取向和读码结构插入到载体的多克隆位点区内，因此，cDNA编码的蛋白质便与GAL4-AD产生融合作用，形成杂种蛋白质Ⅱ。这2种杂种蛋白质都能在酵母细胞中得到高水平的表达，而且在核定位序列（nuclear localization sequence）的作用下进入到酵母的细胞核内。pGBT9中的核定位序列是GAL4DNA结合域序列中间的一部分。而在pGAD424载体中，核定位序列是SV40的T抗原序列，被克隆在ADH1启动子和GAL4激发结构域序列之间。SV40的核定位序列使核内的蛋白量可以满足检测的灵敏度需要。

3酵母双杂交的应用

3.1利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能

酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病密切相关。为了研究2个蛋白之间相互作用的结合位点，找到影响或抑制2个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1~65个氨基酸残基和Synphilin-1的349~555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。

3.2利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用

酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，研究抗原和抗体之间的相互作用，但是它们都是基于体外非细胞的环境研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体单链的3个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的3个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化到改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。

3.3利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响

酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）和拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。

3.4利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）

众多的蛋白质在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。HUA等人利用酵母双杂交技术，以所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动，如信号传导、代谢途径等有重要意义。

4参考文献

[1] 张树民，陈英碚.酵母双杂交体系的新发展[J].国外医学遗传学分册，1999，22（5）：225-227.

[2] FIELDS S，SONG O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions[J].Nature，1989，20（340）：245-251.

[3] WONG C，NAUMOVSKI L.Method to screen for relevant yeast two-hybird-derived clones by coimmunoprecipitation and colocalization of epitope-tagged fragments-application to Bd-XL[J].Anal Biochem，1997，252（1）：33-41.

[4] BRENT R，PTASHNE M.A eukargotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of aprokaanyotic repreesor[J].Cell，1985，43（3）：729-736.

[5] MA J，PTASHNE M.Converting a eukanyotic transcriptional inhibitor into an activator[J].Cell，1988，55（3）：443-448.

[6] YANG M，FIELDS S.Protein-peptide intevactions andyzed with the yeast two-hybird system[J].Nucleic Acids Res，1995（23）：1152-1156.

[7] WATSON MA，BUCKHOLZ R，WEINER MP.Vectors encoding alte-rnative antibiotic vesistance for use in the yeast two-hybird system[J].Biotechniques，1996，21（2）：255-259.

[8] BEMIS LT，GESKE F J，STRANGE R.Use of the yeast two-hybird system for identifying the cascade of protein interachions resulting in apoptotic cell death[J].Methods Cell Biol，1995（46）：139-151.

[9] JAMES P，HALLADAY J，GRAIG E A.Genomic libraries and a host strain desingned for highly efficient two-hybird selection in yeast[J].Genetics，1996（144）：1425-1436.