谢雪迎 任鹏飞 朱常香 宫志远

摘 要:采用拮抗试验和酯酶同工酶谱分析两种生物学方法对24个香菇菌株进行鉴定和分类,构建树状图。结果表明:拮抗试验受外界环境影响大,可用于香菇菌株的初步分类;酯酶同工酶谱带丰富,可以完成香菇菌株的鉴定,在聚类图谱0.84的水平上24个香菇菌株可以分为10大类。

关键词:香菇;分类;拮抗;酯酶同工酶

中图分类号:S646.1+20.37 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2009)12-0036-04

香菇(Lentinula edoeds)是世界上最主要的食用菇类栽培品种之一,在食用菌的产量构成中占有重要地位,1994～1995年世界食用菇类总产量达490×104 t,其中香菇占15%[1]。由于其味美质嫩和具有增强人体免疫功能的特殊作用,香菇已成为全球性备受欢迎的功能食品。

我国是世界香菇栽培的起源地,从发明最原始的“砍花法”以来,迄今已有1 500多年的栽培历史[2]。我国拥有世界上最丰富的香菇种质资源,在香菇生产的三大要素(菌种、培养料、栽培管理)中,菌种是最重要的基础生产资料,是影响香菇产量及质量构成的关键因子。我国香菇生产快速发展的主要原因之一,就是引进和选育了一大批优质、高产、抗逆性强的菌种。由于目前香菇菌株同名异物和同物异名现象严重,故对香菇菌株进行有效的分类和鉴定就成了香菇新品种选育的基础和前提。本试验对24个香菇菌种通过拮抗和酯酶同工酶试验进行了分类和鉴定,旨在为后来的选育工作提供依据[3]。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试的香菇菌株见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗试验 挑取大米粒大小的两菌株种块于90 mm培养皿内对峙培养,种块间距1.5～2.0 cm。每个菌株重复3次,于25℃培养20 d,观察结果并拍照。

1.2.2 菌丝体培养 参考林芳灿的方法[4],将参试菌株在相同条件下接种于PDY液体培养基中进行浅层培养,培养量以各自可以做3个平行试验为准。

1.2.3 同工酶分析 收集供试菌株菌丝体各3份,液氮研磨。将研磨后的样品在4℃、10 000 r/min离心10 min,取其上清液。将上清液、蔗糖溶液和溴酚蓝指示液按5∶1∶1的体积比混合作为电泳样品。经SDS-PAGE电泳,取分离胶染色,拍照。

1.2.4 试验结果的观察和统计分析 观察样品酶带的位置,计算每条酶带的相对迁移率(Rf)。Rf按下列公式计算:

Rfn=d璶/d

式中:Rfn为条带n的相对迁移率;d璶为条带n的迁移距离(cm);d为溴酚蓝的迁移距离(cm)。

同时将凝胶照相存图。根据菌株每条酶带的出现与否,计算各菌株间的遗传相似系数。

2 结果与分析

2.1 拮抗试验

24个香菇菌株共设计拮抗组合276组,拮抗现象不明显的有25组,占9.1%,其中L26与中香1号、香66-2、856、50826没有拮抗,亲缘关系较近;SNL23与HW021、SNL8、香62亲缘关系较近;中香1号与狮子头、野生香菇亲缘关系较近;香939与中香2号、日大亲缘关系较近。其它组合的11个菌株拮抗现象比较明显。因而拮抗试验结果可将24个香菇菌株初步分为14类(图1、表2)。

2.2 酯酶同工酶谱分析

提取24个香菇菌株的酯酶同工酶进行聚丙烯凝胶电泳,共得到73条谱带,各菌株谱带1～5条不等,相对迁移率介于0.29～0.92之间(见表3)。各菌株间谱带的深度和宽度有明显差异,宽且深的谱带说明酶含量高,活性大;窄且浅的表明酶含量低,活性小。根据谱带的深浅和宽窄,可将所有谱带分为四级:一级酶带色深带宽;二级酶带色较深而宽;三级酶带色较浅而窄;四级酶带色浅而窄(图2)。

2.3 聚类分析

根据酯酶同工酶电泳结果,将同一相对迁移率位置上有条带记为1,无条带记为0,构建矩阵并用NTSYS进行分析[5]。聚类分析结果(图3)表明,所有参试菌株在0.68的相似水平上可以归为一类,在1.00水平上归为22类,变异范围为0.68～1.00。在1.00水平上,9015和9508、狮子头和申香10号相似系数很高,可认为是一个菌株。在0.84水平上分为10大类,其中136.3、856、泌阳3、SNL8、古香66、中香1号各成一类;香62、闵丰1号、9508和9015归为一类;SNL23、野生香菇、HW021、秋栽6号、香菇939、50826归为一类;日大、高温香菇、香66-2归为一类;申香10号、狮子头、中香2号、L26、241-4归为一类。

3 结论与讨论

与生化标记、分子生物学标记相比,拮抗试验结果主观性强,菌丝生长状况受外界环境的影响很大,往往使观察结果与其它鉴定手段相悖。本试验中,在没有拮抗线的试验组合中,也能观察出菌丝生长状况的明显不同,这说明其菌株遗传背景差异还是有的,只不过没有在平板上显现出来而已。所以拮抗试验只能用于菌株的初步分类。

在生化标记中,酯酶同工酶的稳定性最好,是目前菌种鉴定的常用方法。但酯酶同工酶的测定对培养条件的一致性要求较高,并且不同菌株、不同发育时期、不同部位的酶谱也不一致[6]。故所有处理必须具备相同的培养条件和提取条件,才能保证酶谱分析的客观性。本试验中,香菇共同性谱带不清楚,可能与提取条件有关。

聚类分析通过酶谱条带的有无构建矩阵,并利用NTSYS软件绘制树状图、计算相关系数。但在多大的遗传系数上进行分类最为合理,需要进一步的研究。本试验的遗传系数介于0.68～1.00之间,所取的分类点为0.84,是两者的平均数。

参 考 文 献:

[1] Chang shu-ting.Mushroon Biology and Mushroon Products[M].Chinese University press,1997,1-10.

[2] 杨新美.中国食用菌栽培学[M]. 北京:中国农业出版社,1988,292-294.

[3] 吕作舟,刘巧云.我国香菇育种的回顾与展望[J].中国食用菌,1996,15(1):5-6.

[4] 林芳灿,高国琪.香菇主要数量性状遗传率及相关性研究[J].华中农业大学学报,1993,12(1):27-30.

[5] 盖均镒.试验统计方法[M].北京:中国农业出版社,2000,35-46

[6] 王 镭,张 婤,潘迎捷,等.利用方差分析和聚类分析法进行香菇种质资源评价[J].食用菌学报,1997,4(3):21-24.