樊娜娜 郭 晓 刘生祥 杨 煜 张柏顺 范仲学 李广存

摘 要:马铃薯是重要的粮菜兼用作物,但其受青枯病的影响严重,一直以来没有根本的防治措施。随着分子生物学的发展,利用基因工程技术研究抗青枯病相关基因的功能,进而进行遗传转化,培育抗病品种(系)将成为一条经济有效的途径。本文在前期研究的基础上对几种抗青枯病相关基因的研究进展、RNAi技术在研究基因功能中的作用以及农杆菌介导的遗传转化技术的应用等进行了综述。

关键词:马铃薯;青枯病;基因;RNAi

中图分类号:Q789 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2009)12-0012-05

马铃薯原产于南美洲的秘鲁和玻利维亚等地,后在世界各地广泛种植,是重要的粮菜兼用作物,单位面积产量高,营养丰富,用途广泛,经济价值高,抗旱性好,耐贮藏。目前马铃薯在我国的种植面积和产量均居世界首位。近几年,随着种植业结构的调整及西部大开发战略的实施,马铃薯正成为我国许多省及自治区的经济作物和优势产业,种植面积也逐渐扩大。马铃薯青枯病是由青枯病菌(也叫茄科雷尔氏菌,即Ralstonia solanacearum)引起的一种细菌性土传病害,寄主范围广,涉及50多个科的数百种植物[1]。该病目前还没有有效的防治措施,化学药剂防治易造成环境污染和病原菌抗性小种突变,农业综合防治效果有限。选育抗青枯病品种是最为经济有效的途径之一,然而,迄今为止,尚未在马铃薯栽培种中发现有效的青枯病抗源。研究发现,二倍体马铃薯野生种中存在青枯病抗源,但由于青枯病抗性机制复杂,存在寄主、环境、病原小种的互作效应等,人们对青枯病的抗性机制仍然知之甚少。随着分子生物学的发展,克隆抗病基因并进行同源基因转化,培育抗病品种已成为一条重要而有效的途径,例如抗虫棉的获得等。因此本文对获得的几个抗青枯病相关基因的研究进展及基因功能验证方法进行了综述。

1 马铃薯抗病相关基因的研究进展

1.1 编码蛋白激酶的基因

蛋白激酶是通过催化蛋白质磷酸化进而改变其活性的一类酶,这类酶以ATP 或GTP 作为磷酸基团的供体,并将磷酸基转移到底物中特定的氨基酸残基上。根据蛋白激酶磷酸化底物中氨基酸残基的不同,可将真核生物中的蛋白激酶分为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶( STK) 和酪氨酸蛋白激酶( PTK)两大类,这两类蛋白激酶功能域相似,但却具有各自特征性的氨基酸序列区段,从而决定它们催化底物的特异性[2]。

1.1.1 植物蛋白激酶的功能

植物中的蛋白激酶几乎与所有的发育过程有关,在发育、自交不亲和、雄性不育、抗逆和抗病等生命活动过程中均起着重要的调控作用[3]。蛋白质磷酸化与去磷酸化过程在细胞的信号转导中起重要作用,是生物体中普遍存在的一种调节机制。许多比较复杂的信号转导系统都牵涉到瀑布式的由多个蛋白激酶所催化的磷酸化反应,从而使最初感受到的信号得到放大[4]。以往人们对蛋白激酶的了解绝大部分来自动物和酵母,植物蛋白激酶的研究起步较晚,但进展很快。动物蛋白激酶的绝大多数种类已在植物中发现。研究表明,植物中的蛋白激酶大都属于丝/苏氨酸类蛋白激酶。如水稻抗白叶枯病基因Xa21[5] 和Xa26[6都编码具有LRR 区的丝/苏氨酸激酶。水稻抗稻瘟病基因Pi2d2[7]编码的蛋白质胞外是B凝集素(B-lectin) 结构,胞内是丝/苏氨酸激酶区。Sasabe等[8]从烟草中分离的3个NtlecRK能被激发子(elicitor) 诱导,N端是豆凝集素结构域,有跨膜区,C端是丝/苏氨酸类型的激酶结构域。拟南芥的FLS2基因编码含LRR 结构域的类受体激酶,在植物抗病和病原菌识别中起重要作用[9]。大麦的Rpg1基因编码的蛋白激酶具有抗锈病的功能[10]。不仅如此,某些植物特有的蛋白激酶研究也取得了进展。如TDY类丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 有60～80个氨基酸的N端KD区,有些具有C端CD区作为MAPKK、磷酸酶和底物蛋白的停泊位点[11]。TDY类MAPK的功能主要与机械性伤害、紫外线胁迫、H2O2 胁迫及重金属胁迫等各种环境胁迫相关。TDY类MAPK相对于其它类的MAPK在进化上是相对独立的,具有多个起源。

1.1.2 植物蛋白激酶中的类受体激酶

与动物中的受体激酶类似,植物中的蛋白激酶是一类定位在质膜上,包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内激酶域的膜蛋白[12]。这类蛋白激酶的分子结构和功能类似动物细胞中的受体蛋白激酶(receptor protein kinase, RPK),且绝大多数尚未鉴定出其配基,故称之为类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinases, RLKs)[13]。不同类受体激酶胞外受体结构的差异较大,据此,可将植物类受体激酶细分为6个亚家族[14]:(1) 具S结构域( S-domain) 的RLK (S-RLK) :其胞外受体部分具有同油菜自交不亲和糖蛋白相似的S结构域; (2) 富含亮氨酸(leucine-rich repeat) 的RLK(LRR- RLK) :具有重复出现的富含亮氨酸的胞外结构域,在分子识别中起重要作用,目前发现的类受体激酶大多属于这一类;(3) 类肿瘤坏死因子受体( tumor-necrosis factor receptor, TNFR) RLK:其胞外受体部分具有特定排列的6个半胱氨酸;(4) 类表皮生长因子( epidermal growth factor, EGF) RLK:这个亚家族的成员具有类似EGF的结构域;(5) PRLK (pathogenesis related protein):该类成员具有PR5相似的结构;(6) 类凝集素(lectin) RLK:其受体部分具有与胞外凝集素相似的结构域。

随着研究的不断深入,人们发现:植物类受体激酶能够在质膜感知外界信号刺激,并传导至胞内,从而引发一系列的生理生化反应,成为植物正常生长发育和抵抗病原菌侵扰不可缺少的参与成员[15],如LRR-RLK参与蛋白-蛋白互作,在分子识别过程中发挥重要的作用[16]; S-RLK与植物的自交不亲和有关,是自交不亲和反应中雌蕊一方的重要因子, S-RLK基因发生突变可导致自交不亲和性丧失[17];拟南芥的RPK1是位于质膜上的一种LRR 受体激酶,在ABA 的信号转导途径中起主要作用[18]。本实验室所研究的RHG1类受体激酶属于富含亮氨酸的RLK,该受体激酶基因受青枯病菌的诱导,但不受茉莉酸(JA)的调节,推测该受体激酶可能作为受体参与了信号识别和抗青枯病反应。

1.2 编码果胶甲酯酶抑制子的基因

果胶是植物细胞壁的主要成分,最初是以高度甲酯化的形式被分泌出来,被果胶甲酯酶去甲酯化后进入细胞壁。果胶甲酯酶对植物发育具有重要的作用[19]。果胶甲酯酶活性的调控受多种因素的影响,果胶甲酯酶抑制子是其中重要的影响因素。自Balestrieri等[20]在研究猕猴桃果胶甲酯酶的特性时发现一种对果胶甲酯酶有抑制作用的蛋白后,在土豆汁液、香蕉果实和无花果中均发现对果胶甲酯酶有抑制作用的物质,这些物质统称为果胶甲酯酶抑制剂[21]。果胶甲酯酶抑制子(Pectin methylesterase inhibitors, PMEIs)通过作用于果胶甲酯酶(PME)形成1∶1的非共价可逆复合体而起作用,这种复合体的稳定性受pH值的强烈影响,二者的亲和力随pH值的降低而升高,致使PME的活性受到抑制。同时pH值的降低也使得细胞中的糖苷酶和糖基转移酶被激活,而糖苷酶和糖基转移酶对于细胞壁的扩展和建立具有重要作用[22],这预示着PME的活性可以通过直接调节pH值及PME与PMEI的亲和力来实现[23]。An等[24]从辣椒中分离和鉴定了CaPMEI1基因,该基因在发生叶枯病的辣椒叶片中编码一种果胶甲酯酶抑制子。重组基因CaPMEI1编码的蛋白不仅抑制PME,而且可作为某些植物病原菌的抗体。在辣椒中,病毒诱导该基因沉默使得辣椒对Xcv(辣椒斑点病细菌)的敏感性增加,并且一些防御相关基因的表达量也减少。这些结果表明,该基因除了参与抗旱和抗氧化胁迫之外,还参与基本的抗病防御。本实验室自马铃薯中获得的StPMEI基因的表达受青枯病菌侵染的抑制,这可能会导致因PMEI的量不足而无法形成足够的非活性状态的PME∶PMEI复合物,从而使PME表现出活性,通过催化产生的具有非酯化的羧基基团与细胞中Ca2+作用形成不溶性的果胶酸盐,加固细胞壁达到早期防御病原侵染的目的。同时该基因又受JA的诱导而上调表达,推测这可能会使得PME以非活性PME∶PMEI复合物的形式存在,引起细胞内pH值的降低,最终使得细胞中的糖苷酶和糖基转移酶被激活,这对于细胞壁的扩展和建立具有重要的作用。影响PME活性的因素较为复杂,PMEI究竟如何通过抑制PME而起作用尚不十分清楚,有关该研究所获得的StPMEI基因在马铃薯中所扮演的角色正在进一步研究中。

1.3 编码蛋白酶抑制子的基因

蛋白酶抑制子是一类广泛存在于植物中的蛋白质,是植物体内自然存在的病程相关蛋白,当植物受到病原侵袭时这些基因被激活从而赋予植物自然抵抗能力[25],其主要通过抑制参与致病过程的外来病原的蛋白酶或消化酶活性,从而导致病原缺乏必需氨基酸的供应而达到抗病的目的[26]。利用蛋白酶抑制子基因,特别是源自植物的抑制子基因进行基因转移创造具有抗病虫性的工程植株,具有广阔的前景,如转Vigna unguiculata的胰蛋白酶抑制子基因的烟草植株具有对病虫的广谱抗性[27]。目前自然界共发现4大类蛋白酶抑制剂[28]:丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。李广存等[29]以马铃薯高抗青枯病基因型ED13为材料,利用cDNA-RGA方法获得了Kunitz型蛋白酶抑制子基因片段,生物信息学的分析表明,该基因是马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制子基因家族的重要成员,进一步的半定量RT-PCR分析表明该基因受青枯病的诱导,推测可能参与了马铃薯的抗病防御。

2 RNAi技术的应用

RNAi(RNA干扰)技术是20世纪90年代中期发展起来的研究特定基因功能的新技术,具有定向、高效、快速、序列特异性强等优点,已成功运用于植物、真菌和脊椎动物等生物体的功能研究中,并为植物基因功能研究提供了一条崭新的思路。最初研究植物中RNAi现象的试验是在马铃薯中通过PTGS(转录后基因沉默)诱导产生抗RNA病毒的能力及在水稻中使报告基因GUS沉默的能力来比较正义链、反义链及dsRNA诱导RNAi效率的高低,结果两个试验都得出同样的结论,即dsRNA比正义链、反义链更能有效诱导目的基因的沉默[30]。现在水稻和拟南芥的基因组测序已经完成,人们获得了大量候选基因,同时其它植物的基因组测序和各种EST (Expression Sequence Tag) 的测序工作也正在进行。这些植物基因组和EST序列信息的获得及测序技术的不断提高使得人们迫切需要一种高效、高通量方法来研究植物基因的功能。RNA干扰技术为分析这些基因功能提供了一种快速、高效的途径,并已取得大量进展[31,32]。此外,Fairbaim等[33]构建了根结线虫(Meloidogyne javanica)靶基因MjTisl1不同发夹结构的RNAi质粒,通过农杆菌介导法转入烟草植株,获得表达不同hpRNA结构的转基因植株。结果表明,寄生于转基因烟草植株的线虫体内的MjTisl1基因被持续沉默,而且这种基因沉默是MjTisl1特异的,线虫体内其它不相关的基因序列不受任何影响。该研究证实了通过在寄主植株中表达靶基因dsRNA能够沉默根结线虫的相应基因。这种方法不仅可用于抗寄生线虫的研究,也适合其它以食植物为生的害虫。在植物和线虫中,RNA沉默也能产生通过细胞边界相互传递的系统信号[34]。该策略的应用有助于更好地理解植物寄生线虫的功能基因组,更好地防治病原和可能的其它一些昆虫病害。郭新梅等[35]用基因枪将构建好的sbeIIb RNAi表达载体pBAC413导入玉米(Zeamays)自交系中,对T1代转基因玉米籽粒淀粉含量的测定结果表明:总淀粉含量与对照相比没有显著变化,但其中一个转基因玉米株系的直链淀粉含量比对照提高了15.6%。为了鉴定我们所获得的几个马铃薯抗青枯病相关基因的功能,本实验室分别利用马铃薯果胶甲脂酶抑制子基因(StPMEI)、蛋白酶抑制子基因(StPI)、类受体激酶基因(StRLK)及转录因子基因(StTF)的特异片段构建了RNA干扰表达载体,并进行了基因转化,现已获得了再生植株,再生植株的表型鉴定工作正在进行中。

3 农杆菌介导的马铃薯遗传转化技术的研究进展

建立高效的植物再生转化系统,是遗传转化成功的前提和保障。农杆菌转化法由于具有费用低、能转移大片段DNA、外源基因拷贝数低并能稳定遗传等优点而备受青睐。农杆菌是从土壤中分离出来的革兰氏阴性细菌,根据宿主范围和致病症状可分为5种[36],其中研究最多也最透彻的是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens),它能将自身Ti质粒的一段DNA(T-DNA)转移到植物细胞中,从而使植物损伤部位形成冠瘿瘤。由于T-DNA转化不具有序列特异性,因此可用任何感兴趣的基因来代替内源的T-DNA基因进行转化[37]。自1983年首次通过农杆菌转化获得马铃薯再生植株至今,国内已获得了不少的马铃薯品种转化植株,如转基因中薯1号、中薯3号、东农303、大西洋、费乌瑞它、布尔班克、黄麻子等,并得到了一些抗晚疫病、青枯病及抗旱的转基因植株[38～40]。在外植体的选择、不同转化条件等方面人们也进行了大量探索,并建立了多种遗传转化体系。本实验室在研究青枯病抗性相关基因的功能时,也建立了二倍体马铃薯基因型ED13和ED25的高效遗传转化体系,并获得了多个马铃薯抗青枯病相关基因的转基因再生植株,为进一步验证这些基因的功能奠定了基础。

4 展望

LRR-RLKs同时具有胞外LRR区和胞内激酶区的结构特点,使其成为植物信号分子传导研究领域的热点,越来越多的研究资料表明,LRR-RLKs在植物的生长发育和防卫反应中起着重要作用。但仍有很多问题尚未解决,如在所有被发现的LRR-RLKs中,只有拟南芥BRI家族和CLV1家族成员的生化功能和作用方式研究的较为透彻,绝大部分的LRR-RLKs的功能和作用方式还知之甚少。这可能是因为:(1)植物信号传导的复杂性。网络状的信号传导模式导致多条传导途径的交叉;(2)不同蛋白功能的互补,导致某个基因突变体表型的恢复,难以获得该基因的正常功能。今后的研究必将加强对LRR-RLKs配体和下游信号分子的搜寻、鉴定和识别,致力于构建每一小段信号传导链,为今后整个信号传导途径网络的构建打下基础。

果胶甲酯酶抑制剂除在植物果胶甲酯酶的活性调控方面发挥重要作用外,在果蔬汁加工业中也具有广阔的应用前景。一般认为,果胶甲酯酶抑制剂对植物果胶甲酯酶的抑制作用为后转录调控[21]。在植物体中,已发现许多果胶甲酯酶同工型,但目前所获得的果胶甲酯酶抑制剂的同工型还很少。随着植物体内果胶甲酯酶抑制剂同工型的不断发现,对果胶甲酯酶活性调控机理的研究将不断深入,这将进一步促进对植物成熟衰老过程的研究。

RNAi作为关闭特定基因功能的新技术,为基因功能的研究提供了一个快速、简便的方法。它的发现激起了世界范围内各个实验室探索基因功能的兴趣,成为研究基因功能的最有用的工具之一。RNAi技术的应用方兴未艾,随着植物资源的广泛开发,相信RNAi技术将为人类探索自然做出更大的贡献。

农杆菌介导的遗传转化技术是一种应用较多的基因转化方法。多年来人们一直致力于影响转化率各个方面的研究,包括基因型、外植体、预培养时间、侵染和共培养时间、农杆菌菌株、载体以及筛选剂等。虽然已经获得了一些高效的马铃薯遗传转化体系,但仍有许多问题亟待解决,如转化率仍然不高、转化受基因型的限制等,今后在此方面的探索将逐步增强,这些问题也将最终得到解决。

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